材料和试剂

材料
1.Rainin 移液器吸头，20- μ L、200- μ L 和 1,000- μ L（Mettler Toledo，目录号：30389291、30389299 和 30389212）
2.血清移液器，5-mL、10-mL 和 25-mL（ThermoFisher，目录号：170355N、170356N 和 170357N）
3.10厘米培养皿（Fisher Scientific，目录号：08-757-105）
4.200 - μL PCR管（ Gunster Biotech，目录号：MB-P08A）
5.一次性塑料比色皿（BRAND，目录号：759115）
6.1.5-mL微量离心管（ Axygen ，目录号：MCT-150-C）
7.15-mL锥形管（ThermoFisher，目录号：339650）
8.50-mL锥形管（ThermoFisher，目录号：339652）
9.Nalgene Oak Ridge PPCO 离心管，42-mL（ThermoFisher，目录号：3119-0050）
10.1-L聚丙烯离心瓶（Beckman Coulter，目录号：A98813）
11.ColiRoller电镀玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：71013）
12.聚醚砜膜过滤器，0.45-µm 孔径，47 mm 直径（Sartorius，目录号：15406-47-N）
13.Millicup -FLEX 过滤单元，直径 47 mm（Millipore，目录号：MCFLX4702）
14.Ni-NTA Superflow树脂（Qiagen，目录号：30450）
15.经济柱，2.5 cm × 10 cm（Bio-Rad，目录号：7372512）
16.经济柱漏斗（Bio-Rad，目录号：7310003）
17.透明的 96 孔微孔板（PerkinElmer，目录号：6005640）
18.Amicon Ultra-15，100-kDa MWCO（Millipore，目录号：UFC910096）
19.0.22-µm 注射器过滤器，PES 膜，直径 33 mm（Millipore，目录号：SLGPR33RS）
20.0.45- μm注射器过滤器，PES膜，直径33 mm（Millipore，目录号：SLHPR33RS）
21.HiTrap Heparin HP，5-mL（ Cytiva ，目录号：17040703）
22.高负荷 Superdex 200 16/600（ Cytiva ，目录号：28-9893-35）
23.预过滤器 6000（GE Healthcare，目录号：18-4582-01）
24.超自由 MC 离心过滤器，0.2-μm（Millipore，目录号：UFC30GV08）
25.Mini-PROTEAN TGX 预制凝胶（Bio-Rad，目录号：4561033）
26.Kimwipes 一次性擦拭器（Sigma-Aldrich，目录号：Z188956）
27.大活页夹，2 英寸（亚马逊，目录号：B07V3VZLG1）
28.一次性注射器，3 - mL和 10-mL（Terumo，目录号：SS-03S 和 SS-10S）
29.23G × 1 1/2" 针（Terumo，目录号：NN-2338R）
30.22G × 2” 金属轮毂针（Hamilton，目录号：91022）
31.塑料食品包装（亚马逊，目录号：B00JPKW1RQ）
32.绿色荧光 F 254二氧化硅薄层色谱板（Sigma-Aldrich，目录号：02554）
33.一次性手术刀片（羽毛安全剃刀，10 号）

试剂
1.SpCas9表达质粒（ Addgene ，目录号：182032）
2.诺瓦根大肠杆菌调谐器（DE3）感受态细胞（Sigma-Aldrich，目录号：70623）
3.Difco LB Broth，Miller（Luria-Bertani）（BD，目录号：244610）
4.很棒的肉汤（BD，目录号：243810）
5.琼脂，细菌学（VWR，目录号：J637）
6.甘油（Fisher Scientific，目录号：G/0650/17）
7.Na 2 HPO 4 •7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：S9390）
8.KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
9.NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
10.NH 4 Cl（Sigma-Aldrich，目录号：213330）
11.异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（ GoldBio ，目录号： I2481C100)
12.霉素单硫酸盐（ GoldBio ，目录号： K-120-50)
13.Difco Terrific 肉汤（BD，目录号： 243810)
14.HEPES（ Sigma-Aldrich，目录号：54457）
15.KCl （Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
16.2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
17.咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I2399）
18.Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：93443）
19.溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L4919）
20.苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：10837091001）
21.来自牛胰腺的 DNase I（Roche，目录号：11284932001）
22.液氮（当地经销商）
23.NuPAGE LDS 上样染料（ThermoFisher，目录号：NP0007）
24.布拉德福德测定试剂（VWR，目录号：E530）
25.TEV蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4455）
26.10 × Tris-甘氨酸-SDS缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：T7777）
27.ExcelBand蛋白质标记物（SMOBIO，目录号：PM2500）
28.InstantBlue Coomassie 蛋白染色剂（Abcam，目录号：119211）
29.用于合成 sgRNA 模板 (IDT DNA) 的 DNA 寡核苷酸
30.Qiagen EB缓冲液（Qiagen，目录号：19086）
31.H 2 O，分子生物学级（Fisher Scientific，目录号：BP2819）
32.KAPA HIFI PCR 试剂盒（Roche，目录号：KK2103）
33.6 ×凝胶上样染料紫（NEB，目录号：B7024S）
34.琼脂糖 I（VWR，目录号：0710）
35.10 × TAE 缓冲器（VWR，目录号：K915）
36.SYBR Safe DNA 凝胶染色剂（ThermoFisher，目录号：S33102）
37.焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma-Aldrich，目录号：40718）
38.Tris（VWR，目录号：0826）
39.MgCl 2六水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
40.亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：85558）
41.聚乙二醇（PEG）2000（Sigma-Aldrich，目录号：8.21037）
42.二硫苏糖醇（DTT）（Roche，目录号：10708984001）
43.ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A2383）
44.UTP（Sigma-Aldrich，目录号：U6625）
45.CTP（Sigma-Aldrich，目录号：C1506）
46.GTP（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
47.T7 RNA聚合酶（Roche，目录号：10881767001）
48.RQ1 RNase-free DNase I（Promega，目录号：M6101）
49.甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F9037）
50.溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：114391）
51.二甲苯氰（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
52.乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
53.尿素（ Sigma-Aldrich，目录号：U5128）
54.5 × TBE 缓冲器（VWR，目录号：J885）
55.40％聚丙烯酰胺，29：1（ACROS，目录号：330215000）
56.过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
57.N,N ,N',N'四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
58.科学器皿 Aquet液体洗涤剂（Sigma-Aldrich，目录号：Z273260）
59.Sigmacote 硅化试剂（Sigma-Aldrich，目录号：SL2）
60.3 M乙酸钠溶液，pH 5（Sigma-Aldrich，目录号：S7899）
61.糖原（Abcam，目录号：AB146544）
62.异丙醇（EMD Millipore，目录号：1.09634.2500）
63.乙醇（Katayama Chemical，目录号：9270）
64.Quick CIP，小牛肠碱性磷酸酶（NEB，目录号：M0525）
65.苯酚：氯仿混合物，低 pH 值（VWR，目录号：0966）
66.氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
67.ToxinSensor显色冻干变形细胞裂解物（LAL）内毒素测定试剂盒（ GeneScript ，目录号：L00350）
68.HCl（Fisher Scientific，目录号：A508-P500）
69.LB+甘油培养基（见配方）
70.很棒的肉汤（见食谱）
71.20 ×修改后的 M9 缓冲器（见配方）
72.1 M IPTG（见配方）
73.50 mg/mL 卡那霉素（见食谱）
74.含有卡那霉素的 LB 琼脂板（参见食谱）
75.裂解缓冲液（见配方）
76.洗涤缓冲液（见配方）
77.洗脱缓冲液（参见配方）
78.IEX A 缓冲区（见配方）
79.IEX B 缓冲液（见配方）
80.凝胶过滤缓冲液（见配方）
81.100 mM PMSF（见配方）
82.10 mg/mL DNase I（来自牛胰腺）（见食谱）
83.0.5 N NaOH + 1 mM EDTA 溶液（见配方）
84.DEPC 处理的 H 2 O（见配方）
85.10 × IVT 缓冲器（见配方）
86.50% PEG 2000（见配方）
87.25 mM NTP 混合物（参见食谱）
88.1 M DTT（见配方）
89.0.5 M EDTA（见配方）
90.2 × STOP 解决方案（见配方）
91.Urea-PAGE 预混物（参见食谱）
92.20% APS（见食谱）
93.1 mg/mL 糖原（见食谱）
94.RNA 溶解缓冲液（见配方）

设备

1.Rainin Pipet-Lite XLS 单通道移液器，2- μ L、20- μ L、200- μ L 和 1,000- μ L（Mettler Toledo，目录号：17014393、17014392、17014391 和 17014382）
2.Thermo Scientific S1 移液管填充器（ThermoFisher，目录号：9501）
3.高压釜（TOMY，目录号：SX700）
4.涡流混合器（Scientific Industries，目录号：G560）
5.AKTA Purifier 10 FPLC 系统（GE Healthcare，目录号：28406264）
6.Mini-PROTEIN Tetra 垂直电泳槽（Bio-Rad，目录号：1658004）
7.SimpliAmp PCR 热循环仪（ThermoFisher，目录号：A24811）
8.迷你凝胶 DNA 电泳系统（ThermoFisher，目录号：B1）
9.Owl P10DS垂直电泳系统（ThermoFisher，目录号：P10-DS-1）
10.Bio-Rad PowerPac HV 电源（Bio-Rad，目录号：1645056）
11.凝胶成像系统（Azure Biosystems，目录号：C300）
12.紧凑型紫外线灯（UVP，目录号：95-0016-14）
13.具有制冷功能的细菌摇动培养箱（TKS，目录号：OSI-500R eco）
14.细胞密度计（WPA，目录号：C08000）
15.带有 0.5 英寸直径探头喇叭的超声仪系统（ Qsonica ，目录号：Q700 和 4420）
16.蠕动泵（EYELA，目录号：MP-2000）
17.Fresco 21 微量离心机（ThermoFisher，目录号：75002555）
34.Allegra 离心机（Beckman-Coulter，目录号：X-30R）
35.Avanti 离心机（Beckman-Coulter，目录号：J-25）
36.用于50-mL锥形管的离心机转子（Beckman-Coulter，目录号：SX440）
37.用于 Oak Ridge PPCO 管的离心机转子（Beckman-Coulter，目录号：JA-25.50）
38.用于 1-L 聚丙烯瓶的离心机转子（Beckman-Coulter，目录号：JLA-8.1）
39.电子秤（Mettle Toledo，目录号：ML3002）
40.pH计（Mettle Toledo，目录号：51302807）
41.NanoDrop Lite 分光光度计（ ThermoFisher ，目录号：ND-LITE-PR）
42.MilliQ水净化系统（Millipore，目录号：MP0024）
43.水浴，设置为 37 °C和 42 °C（FIRSTEK，目录号：B206）
44.加热块，设置为 95°C （Major Science，目录号：MC01N）
45.搅拌板（Corning，目录号：PC620D）
46.250-mL锥形瓶（Pyrex，目录号：4980）
47.2.5-L Ultra-Yield 烧瓶（Thomson，目录号：931136-B）
48.Pyrex 100 -mL 烧杯（DWK Life Sciences，目录号：1000/04D）
49.Pyrex 400-mL 玻璃烧杯（DWK Life Sciences，目录号：1000/14D）
50.Pyrex 500-mL 玻璃瓶（DWK Life Sciences，目录号：1516/08D）
51.Pyrex 1-L 玻璃瓶（DWK Life Sciences，目录号：1516/10D）
52.用于 Pyrex 瓶的 GL45 螺旋盖双软管连接器（Fisher Scientific，目录号：15193927）
53.三爪延长夹具支架（Fisher Scientific，目录号：057697Q）
54.旋转振荡器（ARGOS，目录号：R2200）
55.SpeedVac 真空浓缩器（EYELA，目录号：CVE-2100）
56.酶标仪（Tecan，目录号：M1000Pro）
57.真空泵（Rocker，目录号：400）

软件

1.UNICORN，用于 AKTA FPLC 操作（版本 5. 31）
2.GraphPad Prism 9，用于统计和数据可视化（9.3.1 版）
3.ImageJ，用于图像处理（1.53a 版）

程序

A.SpCas9蛋白的表达与纯化
1.SpCas9 在大肠杆菌调谐器 (DE3)中的过表达
a.制备大肠杆菌生长培养基和储备溶液（见食谱）。
i.准备 50 mL 的很棒的肉汤。在室温下储存。
ii.在 250 mL Erlenmeyer 烧瓶中准备一瓶 100 mL 的 LB+甘油介质，用于起始培养。在室温下储存并在一周内使用。
iii.在 2.5-L 超产量烧瓶中准备三个 1，000 mL LB+甘油介质的烧瓶，用于大型培养。在室温下储存并在一周内使用。
iv.准备 20 ×修改后的 M9 缓冲区。常温保存一年
v.准备库存 1 M IPTG 和 50 mg/mL 卡那霉素溶液。 -20 °C 可保存两年。
vi.μg / mL 卡那霉素的LB 琼脂板。在 4°C 下储存长达一个月。
vii.准备裂解缓冲液。在 4°C 下储存长达一个月。
b.大肠杆菌的转化（第 1 天）
i.在冰上解冻化学感受调谐器 (DE3) 细胞。
ii.将 1 ng SpCas9 表达质粒 ( Addgene ) 添加到 50 μL感受态细胞中。
iii.通过敲击充分混合，并将管在冰上孵育 20 分钟。
iv.将试管置于 42°C 水浴中 60 秒以热休克大肠杆菌。
v.将管子在冰上孵育 2 分钟。
vi.加 500 μL的 Terrific Broth 加入大肠杆菌中，并通过轻敲充分混合。
vii.37°C 振荡 1 小时回收大肠杆菌。
viii.μL的细胞涂抹在含有 50 μg / mL 卡那霉素和无菌玻璃珠的 10 厘米 LB 琼脂板上，直到板完全干燥。
ix.清空磁珠并在 37°C 下孵育板 18 – 20 小时，以形成大肠杆菌菌落。
x.将板储存在 4°C 并在两周内使用。
注意：调谐器 (DE3) 不是维持 cas9 质粒的稳定菌株。我们建议对每批 Cas9 表达进行新的转换。
c.设置起始大肠杆菌培养（第 2 天）
i.加入 2.5 mL 的 20 ×改良 M9 缓冲液和 102 μL的 50 mg/mL 卡那霉素溶液，以重构完整的培养基。
ii.使用无菌移液器吸头从 LB 琼脂板中挑选 4-5 个单菌落并接种到完整培养基中。
iii.在 30°C 下以 200 rpm 摇晃将发酵剂培养 20 小时。不要在更高的模板上长时间过度培养培养物。
d.SpCas9 在大型文化中的表达（第 3 天）
i.将 100 mL 起始培养物分成两个 50 mL 锥形管。
ii.在 4,000 × g和 25°C 下离心10 分钟以收集大肠杆菌，然后倒出培养基。
iii.将两管大肠杆菌颗粒重新悬浮在总共 15 mL 的 Terrific Broth 中。
iv.将 25 mL 的 20 ×改良 M9 缓冲液和 1，030 μL的 50 mg/mL 卡那霉素溶液添加到 1，000 mL LB+甘油介质中，以重构完整的介质。
v.在完整培养基的每个烧瓶中加入 5 mL 的大肠杆菌悬浮液。设置三个烧瓶。
vi.在 37°C 下以 200 rpm 摇晃培养烧瓶。
vii.μL培养物进行采样并确定 600 nm 处的吸光度来监测大肠杆菌密度。
viii.当 600 nm 处的吸光度达到 1.5 时，将烧瓶从培养箱中取出，在冰水中孵育 10 分钟以降低温度。每 2-3 分钟用手摇动烧瓶。
ix.将 IPTG 添加到 500 μ M最终浓度。
x.将烧瓶在 16°C 下以 200 rpm 摇晃过夜 18 小时以诱导 Cas9 表达。
e.大肠杆菌的收获和储存（第 4 天）
i.将大肠杆菌培养物从烧瓶中转移到 1-L 聚丙烯离心瓶中。
ii.离心前在电子秤上平衡瓶子，并用去离子水调整重量。
iii.在 3,500 × g和 4°C 下离心15 分钟以收集大肠杆菌，并倒出培养基。
iv.添加 70 mL 的冰冷裂解缓冲液以重新悬浮大肠杆菌颗粒。
v.使用涡旋和移液的组合来分解大肠杆菌颗粒。将重新悬浮的大肠杆菌放在冰上。
vi.合并大肠杆菌悬浮液并立即进行步骤 2b，通过超声处理大肠杆菌裂解。
vii.大肠杆菌悬浮液等分到 50 mL 锥形管中，将大肠杆菌悬浮液冷冻在 -80°C 。将管子填充至 ±45 mL，以避免在冷冻过程中破裂管子。
viii.将试管转移至 -80°C 以冷冻细胞。冷冻过程会部分破坏大肠杆菌细胞膜并有助于增加细胞裂解。冷冻的大肠杆菌悬浮液在-80°C 下可稳定至少一年。
2.SpCas9的纯化
a.纯化缓冲液和储备溶液的制备（参见配方）
i.准备用于镍亲和层析的裂解、洗涤和洗脱缓冲液。在 4°C 下储存长达一个月。
ii.为肝素离子交换色谱准备 IEX A 和 IEX B 缓冲液。在 4°C 下储存长达一个月。
iii.准备凝胶过滤缓冲液。在 4°C 下储存长达一个月。
iv.准备 100 mM PMSF 库存溶液。 -20°C 可保存一年。
v.制备 10 mg/mL DNase I（来自牛胰腺）溶液。在液氮中快速冷冻 1 mL 等分试样，并在 -80°C 下储存长达两年。
vi.准备 0.5 N NaOH + 0.1 mM EDTA 溶液。在 4°C 下储存长达一年。
b.通过超声处理裂解大肠杆菌（第 5 天）
i.在冷自来水中解冻六管冷冻大肠杆菌悬浮液（~300 mL）。
ii.每 5 分钟轻轻倒置试管，直至冰完全融化，混合大肠杆菌悬浮液。
iii.在细胞颗粒解冻时，在超声探头下方设置一个 400 mL 的玻璃烧杯，其中包含一个搅拌棒和一个搅拌板。
iv.在室温下将 30 mg 溶菌酶溶解在烧杯中的 30 mL 裂解缓冲液中。
v.将解冻的大肠杆菌悬浮液倒入烧杯中。
注意：解冻的大肠杆菌悬浮液应该是粘稠的，因为冷冻会引起部分细胞裂解。
vi.将烧杯放在冰桶的中心，并用冰围绕烧杯以在超声处理期间保持低温。
vii.将装有烧杯的冰桶放在搅拌板上，并设置为 100 rpm 以使大肠杆菌悬浮液均质化。
viii.在搅拌的同时，慢慢地将 3 mL 的 100 mM PMSF 溶液逐滴加入大肠杆菌悬浮液中。
ix.搅拌时，将 1 mL 的 10 mg/mL DNase I（来自牛胰腺）添加到大肠杆菌悬浮液中。
x.将超声探头浸入大肠杆菌悬浮液中约 1.5 英寸深。
注意：大肠杆菌悬浮液在超声处理前应呈现不透明并呈淡黄色。
xi.裂解大肠杆菌，以均质化细胞裂解物并减少超声探针产生的热量。
大肠杆菌裂解物的高粘度，搅拌棒的均质化在最初的几轮超声处理中可能无效。我们偶尔会暂停超声处理并使用抹刀搅拌裂解液几次。根据需要经常重复此方法，以帮助均匀温度和含量。随着超声处理的进行，裂解物应逐渐变得不那么粘稠和更半透明。
xii.将 37 mL 的大肠杆菌裂解物转移到橡树岭 PPCO 管中。根据需要使用尽可能多的管子。不要将管子装得过满，以免在离心过程中泄漏。
xiii.在电子秤上平衡试管，并通过添加裂解缓冲液调整重量。
xiv.在 20,000 × g和 4°C 下离心 30 分钟。将上清液混合在一个干净的 500 mL 玻璃瓶中，并在冰上预冷。
xv.通过 0.45-μm 过滤器过滤上清液以完全去除细胞碎片。将可溶性大肠杆菌裂解物收集在冰上预冷的干净 500 mL 瓶中。
xvi.取样 5 μL可溶性裂解物，与 40 μL的 1 × NuPAGE上样染料，将混合物在 95°C 加热 5 分钟以进行 SDS-PAGE 分析。
c.镍亲和色谱法（第 6 天）
i.在 50 mL 锥形管中用 20 mL 去离子水清洗 20 mL 的 Ni-NTA（20%（v/v）乙醇中的 50%（w/v）浆液）。通过轻轻倒置试管进行混合。
ii.在 3,000 × g和 4°C 下离心 5分钟，并通过移液器丢弃上清液。
iii.在 40 mL 的裂解缓冲液中重新悬浮 Ni-NTA 树脂。通过轻轻倒置试管进行混合。
iv.在 3,000 × g和 4°C 下离心 5分钟，并通过移液器丢弃上清液。
v.通过移液将 Ni-NTA 树脂重新悬浮在 20 mL 的裂解缓冲液中。
vi.将 Ni-NTA 浆液转移到含有可溶性大肠杆菌裂解物的 500 mL 瓶中。
vii.将搅拌棒放入瓶子中，然后将瓶子放在搅拌板顶部的冰桶中孵育。
viii.通过以 100 rpm 的转速搅拌 20 分钟，在冰上混合 Ni-NTA 和大肠杆菌裂解物，以捕获带有 His 标签的 Cas9 蛋白。
ix.将 Bio-Rad Econo 色谱柱 (2.5 cm × 15 cm) 连接到 Econo 色谱柱漏斗，然后将色谱柱安装在夹具架上。在 4° C下执行以下步骤，并让裂解液和缓冲液通过重力流过色谱柱。
x.通过移液将 Ni-NTA 和裂解浆装入柱中。丢弃流过。
xi.用 400 mL 的裂解缓冲液清洗柱子。
注意：通过缓慢移液加载缓冲液，尽量不要干扰树脂床。裂解缓冲液含有 0.5% (v/v) Triton X-100，有助于洗去柱子上的内毒素。
xii.用 400 mL 的洗涤缓冲液清洗色谱柱。
注意：洗涤缓冲液含有 1 M KCl ，有助于去除与 Cas9带正电荷的活性位点结合的核酸污染物。
xiii.通过移液将洗脱缓冲液添加到柱中，并在 15 mL 管中收集一系列 5 mL 级分。
xiv.μL的洗脱液并在 96 孔板中与 50 μL 的 1 × Bradford 试剂混合，通过Bradford 测定检查每个馏分。
注意：Bradford 检测试剂为棕色，但与蛋白质混合后变为蓝色。颜色变化是肉眼可见的。
xv.Amicon Ultra 管 (15-mL, 100-kDa MWCO)中将组分与大量蛋白质结合。
xvi.在 4,000 × g和 4°C 下离心 15 分钟。用更多的蛋白质洗脱液重新填充管子，轻轻颠倒管子 4-5 次以混合内容物。
xvii.mL的最终体积。
xviii.移液器轻轻混合浓缩的洗脱液。
xix.μL浓缩洗脱液样品，与 40 μL 1 × 在 1.5-mL 微量离心管中加入NuPAGE上样染料，将混合物在 95°C 加热 5 分钟进行 SDS-PAGE 分析。
xx.将洗脱液转移到新的 50 mL 锥形管中。
xxi.将 TEV 蛋白酶混合到浓缩的洗脱液中，从重组 Cas9 蛋白中切割出麦芽糖结合蛋白融合物和 12 × His 标签。推荐的比例是 1:100 (w/w) 或10,000 单位(1 mg) TEV 蛋白酶与 100 mg 的目标蛋白，通过 280 nm 处的吸光度测量。
xxii.将反应在 4°C 下过夜孵育约 18 小时。
d.肝素离子交换色谱法（第 7 天）
i.取样 5 μL的 TEV 反应混合物，与 40 μL的 1 × 在 1.5-mL 微量离心管中加入NuPAGE上样染料，将混合物在 95°C 加热 5 分钟进行 SDS-PAGE 分析。
ii.使用 10 mL 血清移液器将 10 mL 的 IEX A 缓冲液添加到 TEV 反应混合物中。将移液器浸入混合物中，轻轻旋转溶液并缓慢释放 IEX A 缓冲液。
提示：虽然 Elution 和 IEX A 缓冲液的成分相似，但我们有时会在 IEX A 缓冲液加入过快时观察到蛋白质沉淀，从而导致 Cas9 蛋白丢失。将前几毫升的 IEX A 缓冲液缓慢引入浓缩的 Cas9 和 TEV 混合物非常重要。
iii.用同样的方法慢慢加入另外 20 mL 的 IEX A 缓冲液。
iv.使蛋白质混合物通过0.45- μ m 注射器过滤器以去除蛋白质沉淀。注意：当正确执行步骤 A-2-d-ii 时，应该没有可见的蛋白质沉淀。当出现大量沉淀时，将蛋白质溶液在 4,000 × g和 4°C 下离心 15 分钟以除去沉淀物，然后过滤。无论沉淀如何，建议进行过滤以去除颗粒并有助于延长色谱柱的使用寿命。
v.连接两个 5 mL HiTrap Heparin HP 色谱柱。
vi.通过蠕动泵以约 3 mL/min 的流速在 4°C 下用 50 mL IEX A 缓冲液平衡色谱柱。
vii.通过蠕动泵在 4°C 下以 ~3 mL/min 将蛋白质混合物加载到柱中。收集流过分数。
viii.取样 5 μL的流过馏分，与 40 μL的 1 × 在 1.5-mL 微量离心管中加入NuPAGE上样染料，将混合物在 95°C 加热 5 分钟进行 SDS-PAGE 分析。
ix.使用 IEX A（入口 A）和 IEX B（入口 B）缓冲液对 AKTA Purifier FPLC 执行系统清洗，然后使用 IEX A 缓冲液平衡流路。
提示：FPLC 泵冲洗溶液（20% 乙醇）必须每月更换一次，以避免 FPLC 系统中的微生物生长并降低蛋白质样品中内毒素污染的风险。
x.将肝素柱连接到 FPLC，并以 3 mL/min 的速度用 100 mL 的 IEX A 缓冲液清洗柱子。
xi.以 3 mL/min 的速度在 150 mL 上以 0% 至 80% 的 IEX B 缓冲液的线性梯度洗脱蛋白质。
xii.组合峰分数，如图 2 所示。
xiii.将蛋白质洗脱液转移到Amicon Ultra 管（15-mL，100-kDa MWCO）。
xiv.在 4,000 × g和 4°C 下离心 15 分钟。用更多的蛋白质洗脱液重新填充管子，轻轻颠倒管子 4-5 次以混合内容物。
xv.mL的最终体积。储存在冰上。
xvi.μL浓缩肝素洗脱液样品，与 40 μL 1 × 在 1.5-mL 微量离心管中加入NuPAGE上样染料，将混合物在 95°C 加热 5 分钟进行 SDS-PAGE 分析。

图 2.肝素色谱的洗脱曲线。
在我们的缓冲系统中，Cas9 以 ~62 mS/cm 的电导率被洗脱。

e.Superdex 200 凝胶过滤色谱法（第 7 天和第 8 天）
i.从肝素色谱后第 7 天开始，将 2 mL 样品环连接到 FPLC，并用去离子水进行系统清洗。
ii.连接前置过滤器 6000 和HiLoad Superdex 200 16/600 色谱柱连接到FPLC，并在整个纯化过程中根据制造商的协议设置压力警报和流速 (0.8–1 mL/min)。
iii.用 250 mL 的 0.5 N NaOH + 0.1 mM EDTA 溶液清洁流路（包括样品回路、预过滤器、Superdex 柱和馏分收集器）。
iv.用 250 mL 的去离子水冲洗流路。
v.用 250 mL 的凝胶过滤缓冲液平衡流路。
vi.在第 8 天，将浓缩蛋白转移到连接到 22G × 2" 金属毂针的 3 mL 注射器中。避免气泡。
vii.将浓缩蛋白装入 FPLC 上的 2 mL 样品循环中。
viii.以 1 mL/min 将蛋白质注入 FPLC。
ix.进样后在约 62 mL 保留体积处合并峰级分，如图 3 所示。
x.将组合的 Cas9 分数转移到Amicon Ultra 管（15-mL、100-kDa MWCO）。
xi.在 4,000 × g和 4°C 下离心 15 分钟。用更多的蛋白质重新填充试管，轻轻颠倒试管 4-5 次以混合内容物。
xii.重复离心过程，将 Cas9 蛋白浓缩至 ±2 mL。
xiii.取样 5 μL浓缩的 Cas9 蛋白，与 40 μL的 1 × NuPAGE上样染料，将混合物在 95°C 加热 5 分钟以进行 SDS-PAGE 分析。
xiv.使用NanoDrop Lite 分光光度计测量 Cas9 蛋白在 280 nm 处的吸光度。
xv.通过比尔定律估计 Cas9 的摩尔浓度。重组Cas9的理论消光系数为126410 M -1 cm -1 。
xvi.继续将 Cas9 浓缩至40 μ M。如果浓度过高，用凝胶过滤缓冲液稀释 Cas9。

图 3. Superdex 200 色谱的洗脱曲线。
在我们的条件下，Cas9 的保留时间约为 62 mL。

f.Cas9 的灭菌、冷冻和分析（第 8 天）
i.用 400 μL凝胶过滤缓冲液预湿 Ultra-free MC 离心过滤器 (0.2- μ m)。
ii.12,000 × g离心机和4°C 1 分钟。丢弃流过。
iii.每管400 μL转移到离心过滤器中。
iv.12,000 × g离心机 4 °C 1 分钟。丢弃过滤管。
v.μL PCR 管中分装 Cas9，每管 11 μL 。每次移液后立即将管子在液氮中快速冷冻。
vi.将 Cas9 等分试样存放在 -80°C 冰箱中。 Cas9 蛋白至少可以稳定一年。避免反复冻融。
vii.在 ddH 2 O中将 10 × Tris-甘氨酸-SDS 缓冲液稀释至 1 × 。
viii.× Tris-甘氨酸-SDS 电泳缓冲液中的 Mini-PROTEIN Tetra 垂直电泳槽中运行 Mini-PROTEAN TGX 预制凝胶 (10% PAGE)，以分析纯化过程中收集的样品。用考马斯蛋白染色剂对 PAGE 进行染色（图 4A）。
注意：最终的 Cas9 蛋白在 C 端带有一个用于检测的 3XFLAG 亲和标签和一个用于核输入的 3 ×核定位序列（图 4B）。

图 4. 重组 Cas9 蛋白的纯度。
(A) 对在不同纯化阶段取样的 Cas9 蛋白进行 SDS-PAGE 分析。凝胶图像由 Azure 成像系统拍摄。 (B) 重组 Cas9 表达为融合蛋白，其 N 末端带有麦芽糖结合蛋白 (MBP)，C 末端带有 3X FLAG 标签、3X 核定位序列 (NLS) 和 12X His 标签。有两个 TEV 位点允许通过 TEV 切割分离 MBP 和 12X His 标签。

B.sgRNA的合成和纯化
1.sgRNA的酶促合成
a.通过重叠 PCR 合成 sgRNA 转录模板（第 1 天）
i.在 Qiagen EB 缓冲液中制备 1 mM 的顶部和底部寡核苷酸预混物（序列如下）。 -20°C 可保存一年。
顶部寡核苷酸
5'- TAATACGACTCACTATA G-引导序列-GTTTTAGAGCTATGCTGGAAACAG
CATAGCAAGTTAA-3'
底部寡核苷酸
5'-GCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAA
CTTGCTATGCTGTTTCCAGCAT-3'
注意：斜体序列 (TAATACGACTCACTATA) 是 T7 启动子，其中 T7 RNA 聚合酶在启动子序列下游的第一个鸟苷（G，以灰色突出显示）处结合并启动 RNA 合成。理想情况下，间隔序列应以5 '开头 G 启用体外转录 (IVT)。对于5 '处没有 G 的目标在间隔子的末端，必须在完整的 20-nt 间隔子上附加一个额外的 G。生成的 sgRNA 将在5 '处携带额外的 G sgRNA 的末端。或者，可以使用 Ribozyme-gRNA-Ribozyme 策略来保留完整的间隔序列并在 5 ' sgRNA 的末端（ Rouet等人，2018；Zhang 等人，2017）。

ii.在 Qiagen EB 缓冲液中制备 10 mM 正向和反向引物预混物（序列如下）。 -20°C 可保存一年。
正向引物
5'-TAATACGACTCACTATAG-3'
反向底漆
5'-GCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAG-3'
注意：顶部和底部寡核苷酸的退火和延伸在技术上足以生成用于 IVT 的双链 DNA 模板。然而，在 PCR 反应中添加正向和反向引物显着增加了 DNA 模板的产量。重叠 PCR 的原理如图 5A 所示。

图 5。通过重叠 PCR 合成 sgRNA DNA 模板。
(A) 使用四种 DNA 寡核苷酸的重叠 PCR 示意图。 (B) 通过 DNA 凝胶电泳和 SYBR 安全染色对 DNA 模板进行可视化。显示了三个 DNA 模板的例子。 (C) IVT 反应产生的白色沉淀是焦磷酸盐，不溶于水（箭头标记）。

iii.如下所示，使用 KAPA HIFI PCR 试剂盒设置 30- μ L PCR 反应：
零件体积（ μL ）最终浓度
H 2 O，分子生物学级18不适用
5 × KAPA HIFI 缓冲器61 ×
1 mM 顶部和底部预混液1.550微米_
10 mM 正向和反向预混液31毫米
卡帕 dNTP0.92毫米
KAPA HIFI 聚合酶0.60.6U
注意：其他品牌的 DNA 聚合酶和 PCR 试剂盒也可用于生成 DNA 模板。请参阅制造商的协议以优化 PCR 条件。

iv.在以下热循环仪设置中运行 PCR：
温度 (°C)时间（秒）周期数
95601
981030
5910
7210
721201
4抓住1

v.将 2 μ L PCR 产物与 5 μ L 1 × Gel Loading Dye Purple 混合。
vi.在 Mini Gel 电泳系统中，在 100 V 的1 × TAE 缓冲液中的 2% (w/v) 琼脂糖凝胶中运行 DNA 凝胶电泳。
vii.根据制造商的说明，用 SYBR Safe 对凝胶进行染色，以确认 sgRNA 模板的大小（图 5B）。
viii.无需 PCR 清理即可进行 IVT 反应。或者，在 -20°C 下储存长达一年。
注意：我们没有观察到使用纯化的 DNA 模板（通过 Qiagen PCR 清洁试剂盒）与未纯化的 IVT 模板的 sgRNA 产量有任何差异。 KAPA PCR 缓冲液似乎与我们的 IVT 反应兼容。我们尚未测试其他 PCR 试剂盒的兼容性。
b.体外转录（第 1 天）
i.准备 DEPC 处理的 H 2 O。在室温下储存长达一年。
ii.准备 10 × IVT 缓冲液、50% (w/v) PEG 2000、25 mM NTP 混合物、1 M DTT 和 2 × Stop 溶液。将试剂以 1-mL 等分试样在 -20°C 下储存长达一年（参见配方）。
iii.设置 150- μ L IVT 反应，如下所示：
零件体积（ μL ）最终浓度
DEPC处理过的H 2 O52不适用
10 × IVT 缓冲器151 ×
50% PEG 2000155%
1 M DTT320毫米
sgRNA 模板30不适用
25 毫米 NTP 混合物305毫米
T7 RNA聚合酶5100 单位

iv.将反应在 37°C 下孵育 2 小时。
注：焦磷酸盐的白色沉淀应在孵育 30 分钟后可见（图 5C）。更长的孵育时间可能并不总能增加 sgRNA 的产量，并且容易发生 sgRNA 降解。对于难以转录的 sgRNA 序列，尝试将反应物在 42°C 下孵育 2 小时。
v.加入 1.5 μL 无 RNase 的 DNase I，37°C 孵育 1 h，消化 sgRNA DNA 模板。
vi.混入 150 μL的 2 × Stop 溶液以终止反应。将 IVT 反应混合物储存在 -80°C 直至 PAGE 纯化。 IVT 混合物在 1 × Stop 溶液中稳定至少 3 个月。

2.sgRNA的PAGE纯化
a.变性尿素页的铸造（第 1 天）
i.准备尿素-PAGE 预混物并在 4°C 下储存长达一个月。
ii.准备 20% (w/v) APS。在 4°C 下储存长达一周。
iii.Aquet液体洗涤剂彻底清洗玻璃板、梳子和垫片，然后用纸巾擦干。其他温和的实验室清洁剂都可以。
iv.将玻璃板放在长凳上一张干净的纸巾上。
v.将 100 μ L Sigmacote 硅化试剂涂抹在每个板的上表面。立即用 Kimwipes 将溶液均匀地擦拭在玻璃表面。由于里面的溶剂，溶液应该很快变干。
vi.使用另一块 Kimwipes 去除多余的残留物。玻璃表面应清洁光滑，但不油腻。
vii.放置玻璃板，两个 Sigmacote 涂层表面朝内，垫片夹在中间以组装板盒。
viii.按照制造商的说明在 Owl P10DS 垂直电泳系统上安装尿素-PAGE，并用 1% (w/v) 琼脂糖密封玻璃板的底部。
注意：其他类似凝胶尺寸的电泳系统也与该协议兼容。我们使用 Hoefer SE 600 系列垂直电泳系统（Hoefer，目录号：SE660-15-1.5）获得了相同的分辨率。
ix.将尿素-PAGE 预混物加热至室温。冷预混料不会正确聚合。
x.将以下成分混合在 100 mL 烧杯中，制成 75 mL 尿素-PAGE。
零件体积最终浓度
尿素-PAGE预混料75 毫升1 ×
20% APS150微升_0.04%
TEMED75微升_1/1,000 ×

xi.在室温下搅拌溶液 2 分钟。
xii.使用 25 mL 血清移液器将溶液转移到板盒中。慢慢地将溶液移到板的侧面以避免气泡。
xiii.将梳子插入板之间并用大活页夹固定。
xiv.电泳前让凝胶在室温下聚合至少 2 小时。凝胶应在 10 分钟内开始聚合。
xv.为获得最佳分离效果，让凝胶在室温下聚合过夜。安装电泳外罩以防止凝胶干燥。
xvi.或者，从电泳系统中取出聚合凝胶，将其储存在 4°C 的塑料袋中，并在一周内使用。
b.尿素页上 sgRNA 的电泳（第 2 天）
i.将 IVT 反应混合物（如果储存在 -80°C）和尿素-PAGE（如果储存在 4°C）置于室温。
ii.× TBE 缓冲液填充内部和外部缓冲水库。
iii.使用连接到 23G 针头的 10 mL 注射器，用 0.5 × TBE 缓冲液轻轻冲洗样品孔。
iv.将 IVT 反应混合物装入孔中。
v.将电泳系统连接到 Bio-Rad PowerPac HV 电源。最终设置如图 6A 所示。
vi.在 300V 下运行尿素-PAGE 大约 4 小时，直到溴酚蓝从凝胶中流出，二甲苯青到达 PAGE 底部（图 6B）。全长 sgRNA 应位于 PAGE 的中心。较低的电压不会影响凝胶分辨率，但需要更多时间运行。
vii.断开电泳系统的电源。
viii.从系统中取出尿素-PAGE 并擦去多余的缓冲液。
ix.将板放在干净的工作台表面上，并使用记号笔标记前板。将板翻转过来，顶部有缺口板。

图 6. 通过凝胶电泳可视化和提取 sgRNA。
(A) 在 Owl P10DS 垂直电泳系统上设置尿素-PAGE。孔中的蓝色样本是 sgRNA 混合物。中心孔包含纯化的 sgRNA 标准。 (B) 电泳后，尿素-PAGE 与玻璃板分离，用保鲜膜覆盖，置于荧光薄层色谱板上进行成像。浅蓝色是二甲苯氰。溴酚蓝已经流失了。 (C) 用紧凑型紫外灯对凝胶中的 sgRNA 条带进行可视化。黑色和蓝色条带分别是 sgRNA 和二甲苯氰。长时间的 IVT 反应通常会导致 sgRNA 降解和出现截断的小片段（此处未显示）。所有图像均使用智能手机相机拍摄。

c.尿素页上 sgRNA 的可视化（第 2 天）
i.使用干净的薄金属刮刀去除垫片。垫片应该很容易滑出。
ii.用抹刀轻轻撬开角落的缺口玻璃板。 Sigmacote 有助于将玻璃板与凝胶分离。
iii.用一张塑料食品包装纸盖住凝胶，然后小心地将凝胶与前玻璃板一起翻转。凝胶现在正面朝上。
iv.抹刀撬开前玻璃板，并用保鲜膜覆盖凝胶表面。为避免混淆，请使用记号笔在保鲜膜上标记凝胶方向。
v.将包裹的凝胶放在绿色荧光 F 254二氧化硅薄层色谱板上（图 6B）。
vi.在凝胶顶部放置一个 UVP 紧凑型紫外线灯。打开 UV 以可视化 sgRNA 条带，在绿色背景中显示为黑色（图 6C）。
注意：紫外线是危险的。使用紫外线时，请始终佩戴适当的防护装备。将紫外线灯对准您。
vii.使用记号笔圈出 sgRNA 条带。快速工作以避免因长时间的紫外线照射而损坏 sgRNA。
viii.关闭紫外灯，将玻璃板上的凝胶放回工作台。
ix.使用一次性手术刀片切出 sgRNA 带。使用手术刀片将凝胶片转移到 15 mL 锥形管中。
d.从 PAGE 中提取 sgRNA（第 2-4 天）
i.2 O中制备 70% (v/v) 乙醇。在室温下储存。
ii.制备 1 mg/mL 糖原并储存在 -20°C。
iii.将 5 mL 血清移液器插入锥形管中，将凝胶粉碎成细块。更小的凝胶片可以更好地从凝胶中扩散 sgRNA。
iv.在管中加入 1 mL 的 3 M 醋酸钠（pH 5）和 7 mL 的 DEPC 处理水。最终体积约为 9 mL。
v.将试管在 4°C 的旋转振荡器上孵育过夜，使 sgRNA 从凝胶块中扩散到乙酸钠缓冲液中。
vi.× g和 4°C下旋转凝胶块10 分钟。
vii.将溶液转移到新的 15 mL 锥形管中。体积应为 ±7–8 mL。可以拿起一些凝胶片。
viii.将溶液通过 0.45- μm注射器过滤器以完全去除凝胶片。
ix.加入 20 μL的 1 mg/mL 糖原并充分混合。
注意：糖原作为载体帮助沉淀 sgRNA，在加入异丙醇之前必须充分混合。
x.添加 7 mL 的 100% (v/v) 异丙醇，并通过倒置管子充分混合。
xi.-20°C 孵育管过夜以沉淀 sgRNA。
xii.在 4,000 × g和 4°C 下离心 15 分钟以沉淀 sgRNA。弃去上清液。
xiii.试管中加入 1 mL 的冰冷 70% (v/v) 乙醇，并使用 1 mL 移液器尖端去除和分解 sgRNA 颗粒。
xiv.将混合物转移到 1.5 mL 管中，并在 12,000 × g和 4°C 下离心 2 分钟以降低 sgRNA 沉淀。通过移液丢弃液体。
xv.添加 1 mL 的冰冷 70% (v/v) 乙醇来冲洗 sgRNA 颗粒。在 12,000 × g和 4°C 下离心 1分钟，弃去液体。
xvi.重复乙醇洗涤一次。
xvii.加入 0.5 mL 的无水乙醇来冲洗 sgRNA 颗粒。 12,000 × g和 4°C 离心 1 分钟。通过移液完全去除液体。
提示：无水乙醇从 70% 乙醇洗涤液中吸收痕量的 H 2 O，并加速真空浓缩器中的干燥过程。
xviii.在室温下将 sgRNA 颗粒在 SpeedVac 真空浓缩器中干燥约 5 分钟。 sgRNA 颗粒在完全干燥后应呈白色。干燥后的 sgRNA 颗粒可在 -80°C 下稳定储存 2 年。
3.去除 5' 三磷酸部分
a.小牛肠磷酸酶 (CIP) 反应（第 4 天）
i.通过在室温下孵育 5 分钟，将sgRNA 颗粒溶解在 50 μL的RNA 溶解缓冲液中。轻轻轻弹试管以帮助溶解 sgRNA。
注意：不要使用移液器重新悬浮 sgRNA 颗粒，因为颗粒往往会粘在移液器吸头的内壁上。
ii.μ L的 RNA 溶解缓冲液中稀释 1 μ L的 sgRNA 溶液。
提示：储备 sgRNA 浓度过高，必须稀释才能进行准确的吸光度测量。
iii.NanoDrop Lite 分光光度计上测量稀释的 sgRNA 在 260 nm 处的吸光度。
iv.使用 34,900 g/mol 的理论分子量确定 sgRNA 的摩尔浓度。乘以十倍稀释因子。
注意：步骤 B-1-b 中描述的 IVT 反应产生 4 – 5 nmol 的sgRNA ，相当于 150 μg 。由于引导序列的性质，一些 sgRNA 序列更难以转录，从而降低了 sgRNA 的产量。
v.pmol的 sgRNA 和 40 U 的快速 CIP，在1.5 毫升管中设置 CIP 反应。
vi.在 37°C 下孵育反应 3 小时以去除免疫原性 5' 磷酸基团。立即进行下一步。
b.sgRNA 的提取和沉淀（第 4-5 天）。
i.通过在 DEPC 处理过的水中稀释 3 M 库存溶液来制备 0.3 M 醋酸钠缓冲液（pH 5）。
ii.加入440 μL的 0.3 M 醋酸钠缓冲液（pH 5），将总体积增加到 500 μL 。
iii.添加 500 μ L苯酚：氯仿混合物（低 pH，用于 RNA 提取）。
iv.涡旋 20 秒充分混匀，室温下以 12,000 × g离心 5 分钟。
v.将上层水相转移到 1.5 mL 管中。
vi.加入 500 μL氯仿，涡旋 20 s 充分混匀，室温下以 12,000 × g离心5 min。
提示：氯仿萃取可确保完全去除苯酚，苯酚会破坏 Cas9 蛋白并对细胞有毒。
vii.将上层水相转移到 1.5 mL 管中。
viii.加入 10 μL的 1 mg/mL 糖原并充分混合以帮助沉淀 sgRNA 。
ix.加入 1 mL 100% 异丙醇，充分混合，-20°C 孵育过夜以沉淀 sgRNA。
x.在 12,000 × g和 4°C 下离心 10 分钟以旋转 sgRNA 沉淀。
xi.用 1 mL 的冰冷 70% (v/v) 乙醇清洗 sgRNA 颗粒三次。
xii.用 0.5 mL 的无水乙醇清洗 sgRNA 颗粒一次。
xiii.通过移液完全去除液体。
xiv.在室温下将 sgRNA 颗粒在 SpeedVac 真空浓缩器中干燥约 5 分钟。干燥后的 sgRNA 颗粒可在 -80°C 下稳定储存 2 年。
4.sgRNA的重折叠
a.将 sgRNA 沉淀溶解在 30 μ L的 RNA 溶解缓冲液中，并如步骤 B-3-ai 中所述确定摩尔浓度。
b.将 sgRNA 浓度调整为 48 微米_ 使用 RNA 溶解缓冲液。
c.将 sgRNA 在 65°C 下孵育 5 分钟以部分展开 sgRNA，并逐渐冷却至室温以重新折叠 sgRNA。
d.将 sgRNA 以 10 -μL等分试样在液氮中快速冷冻并储存在 -80°C。 sgRNA 稳定 2 年。避免反复冻融。

C.Cas9 RNP的组装
1.Cas9 蛋白 (40 μM ) 和sgRNA (48 μM )解冻至室温。
2.通过混合等体积的 Cas9 蛋白和 sgRNA，建立 20 μ M的 Cas9 RNP。
注：Cas9 与 sgRNA 的摩尔比为 1 比 1.2。将 Cas9 蛋白添加到 sgRNA 中至关重要，但不能以相反的顺序添加，这样容易引发 Cas9 聚集并降低 Cas9 RNP 的效率。 RNP 浓度是根据蛋白质的浓度计算的，因为它是限制成分。
3.用移液器尖端旋转混合物，同时将 Cas9 蛋白缓慢释放到 sgRNA 中。
4.移液器将溶液混合 4-5次，将 Cas9 RNP 在 37°C 下孵育 5 分钟以形成核糖核蛋白复合物。
5.将 Cas9 RNP 保持在室温下，并在 2 小时内使用。

D.内毒素检测法
1.ToxinSensor显色冻干变形细胞裂解 (LAL) 内毒素检测试剂盒定量 Cas9 和 sgRNA 中的内毒素污染水平。按照制造商的方案重新配制检测试剂，并使用试剂盒中包含的经认证的无内毒素吸头和小瓶。
2.在 1.7 mL 的 LAL 试剂水中重构 LAL。
3.在 1.7 mL 的 LAL 试剂水中重构显色底物。
4.在 LAL 试剂水中稀释的 10 mL 0.46 M HCl 中重新配制终止溶液。
5.在 10 mL 的 LAL 试剂水中重新配制 2 号和 3 号颜色稳定剂溶液。
6.在 2 mL 鲎试剂水中重新配制内毒素标准品，以获得 10 EU/ mL 的储备溶液。
7.将 LAL 试剂水中的内毒素标准品稀释至 0.1 EU/mL、0.05 EU/mL 和 0.025 EU/mL 和 0.01 EU/ mL。
8.在 90 μL 的鲎试剂水中稀释 10 μL 的凝胶过滤缓冲液十倍。设置三个复制。
注：凝胶过滤缓冲液是 Cas9 蛋白储存缓冲液，也是RNA 溶解缓冲液的基础。
9.在 90 μ L 的鲎试剂水中稀释 10 μ L 的库存 Cas9 (40 μ M ) 十倍。设置一式三份。
10.μL的 LAL 试剂水中稀释 10 μL的储备sgRNA (48 μM ) 十倍。设置一式三份。
11.100 μL的 LAL 试剂水（作为空白）、稀释的内毒素标准品以及稀释的 Cas9 和 sgRNA 样品分装到不同的无内毒素小瓶中。设置一式三份。
12.加入 100 μ L 的重组 LAL。轻轻旋转小瓶以避免起泡，充分混合。
13.将小瓶在 37°C 下孵育 5 分钟。
14.加入 100 μL的重组显色底物溶液。轻轻旋转小瓶以避免起泡，充分混合。
15.加入 500 μ L 的重组终止溶液。轻轻旋转小瓶以避免起泡，充分混合。
16.加入 500 μ L 颜色稳定剂 2 号溶液。轻轻旋转小瓶以避免起泡，充分混合。
17.加入 500 μ L 颜色稳定剂 3 号溶液。轻轻旋转小瓶以避免起泡，充分混合。
18.将 200 μ L 的最终溶液转移到 96 孔板中。
19.使用 Tecan 酶标仪测量 545 nm 处的吸光度。

数据分析

1.从内毒素标准品、凝胶过滤缓冲液、Cas9 和 sgRNA 样品的吸光度中减去 LAL 试剂水对照（作为空白）的吸光度。
2.在 Prism 9 软件中根据内毒素浓度绘制内毒素标准品的吸光度。
3.确定四种标准浓度之间的最佳拟合直线以获得标准曲线和方程（图 7A）。
4.使用 545 nm 的吸光度和标准方程计算凝胶过滤缓冲液、Cas9 和 sgRNA 样品中的内毒素浓度（图 7B）。

图 7. Cas9 和 sgRNA 的内毒素污染分析。
(A) 内毒素标准曲线和转换方程。 (B) 来自三个重复的凝胶过滤缓冲液、Cas9 和 sgRNA 中的内毒素平均水平。

食谱

1.LB+甘油培养基
试剂最终浓度数量
Difco LB 肉汤25克/升25 克
甘油0.4% (v/v)4 毫升
ddH 2 O不适用~980 毫升
全部的不适用1,000 毫升
在 121 °C 高压灭菌 15 分钟。在室温下储存。

2.很棒的肉汤
试剂最终浓度数量
Difco很棒的肉汤47.6 克/升2.38 克
甘油0.4% (v/v)0.2 毫升
ddH 2 O不适用~48 毫升
全部的不适用50 毫升
在 121 °C 高压灭菌 15 分钟。在室温下储存。

3.20 ×改进的 M9 缓冲器
试剂最终浓度数量
Na 2 HPO 4 •7H 2 O561 毫米150.4 克
KH 2 PO 4441 毫米60 克
NH 4氯
ddH 2 O187 毫米
不适用10 克
~800 毫升
全部的不适用1,000 毫升
在 121 °C 高压灭菌 15 分钟。在室温下储存。

4.1 M IPTG
试剂最终浓度数量
IPTG1M2.38 克
ddH 2 O不适用10 毫升
全部的不适用10 毫升
μm注射器过滤器对溶液进行消毒。储存于- 20°C 。

5.50 毫克/毫升卡那霉素
试剂最终浓度数量
卡那霉素50 毫克/毫升500 毫克
ddH 2 O不适用10 毫升
全部的不适用10 毫升
μm注射器过滤器对溶液进行消毒。储存于 4°C 。

6.LB琼脂板加卡那霉素
试剂最终浓度数量
Difco LB 肉汤25克/升25 克
琼脂
50 毫克/毫升卡那霉素
ddH 2 O15克/升
50微克/毫升
不适用15 克
1毫升
~970 毫升
全部的不适用1,000 毫升
a.LB 肉汤溶解在 ~980 mL 的ddH 2 O 中。将介质转移到 1-L 玻璃瓶中。
b.加入 15 克琼脂，放入搅拌棒中，在121 °C 下高压灭菌 15 分钟。
c.在搅拌板上搅拌培养基，冷却至 30–40°C。
d.加入 1 mL 的 50 mg/mL 卡那霉素溶液。搅拌均匀。
e.通过血清移液器将 25 mL 溶液转移到 10 厘米培养皿中。
f.让琼脂板在层流罩中冷却和干燥 30 分钟。
g.将盘子存放在 4°C的塑料袋中。

7.裂解缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES20毫米4.77 克
氯化钾
甘油
2-巯基乙醇
咪唑
海卫 X-100
ddH 2 O500 毫米
10% (v/v)
10毫米
70毫米
0.5% (v/v)
不适用37.28 克
100 毫升
700微升_
4.76 克
5 毫升
~860 毫升
全部的不适用1,000 毫升
a.KOH将 pH 值调节至 7.5 ，并使缓冲液通过Millicup -FLEX 过滤装置中的 0.45- μ m 过滤器。
b.要将缓冲液脱气，请将搅拌棒放入瓶中，盖上 GL45 螺帽，然后将瓶子放在搅拌板上。
c.用封口膜密封 GL45 盖上的软管接头之一。通过软管将另一个连接器连接到真空泵。
d.打开真空泵和搅拌板。在不断搅拌下会开始出现气泡。
e.30 分钟后或当缓冲液中不再可见气泡时关闭真空和搅拌板。
f.取下搅拌棒，将 GL45 盖更换为标准瓶盖。
g.将缓冲液在 4°C 下保存一个月。

8.洗涤缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES20毫米4.77 克
氯化钾
甘油
2-巯基乙醇
咪唑
ddH 2 O1000 毫米
10% (v/v)
10毫米
100 毫米
不适用74.55 克
100 毫升
700微升
6.8 克
~820 毫升
全部的无/一1,000毫升_
用 HCl将 pH 值调节至 7 .5 。如裂解缓冲液中所述过滤和脱气缓冲液。将缓冲液在 4°C 下保存一个月。

9.洗脱缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES20毫米4.77 克
氯化钾
甘油
2-巯基乙醇
咪唑
ddH 2 O300 毫米
10% (v/v)
10毫米
400 毫米
不适用22.37 克
100 毫升
700微升_
27.2 克
~880 毫升
全部的不适用1,000 毫升
用 HCl 将 pH 值调节至 7.5。如裂解缓冲液中所述过滤和脱气缓冲液。将缓冲液在 4°C 下保存一个月。

10.IEX A 缓冲区
试剂最终浓度数量
HEPES20毫米4.77 克
氯化钾
甘油
2-巯基乙醇
ddH 2 O300 毫米
10% (v/v)
5毫米
不适用22.37 克
100 毫升
350微升_
~880 毫升
全部的不适用1,000 毫升
将 pH 值调节至 7 .5。如裂解缓冲液中所述过滤和脱气缓冲液。将缓冲液在 4°C 下保存一个月。

11.IEX B 缓冲器
试剂最终浓度数量
HEPES20毫米4.77 克
氯化钾
甘油
2-巯基乙醇
ddH 2 O1000 毫米
10% (v/v)
5毫米
不适用74.55 克
100 毫升
350微升_
~820 毫升
全部的不适用1,000 毫升
用 KOH将 pH 值调节至 7.5 。如裂解缓冲液中所述过滤和脱气缓冲液。将缓冲液在 4°C 下保存一个月。

12.凝胶过滤缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES20毫米4.77 克
氯化钾
甘油
2-巯基乙醇
ddH 2 O150 毫米
10% (v/v)
1毫米
不适用11.18 克
100 毫升
70微升_
~890 毫升
全部的不适用1,000 毫升
用 KOH将 pH 值调节至 7.5 。如裂解缓冲液中所述过滤和脱气缓冲液。将缓冲液在 4°C 下保存一个月。

13.100 毫米 PMSF
试剂最终浓度数量
PMSF100 毫米0.17 克
无水乙醇99%10 毫升
全部的不适用10 毫升
-20°C 可保存一年。

14.10 mg/mL DNase I（来自牛胰腺）
试剂最终浓度数量
来自牛胰腺的 DNase I10毫克/毫升10毫克
裂解缓冲液1 ×10 毫升
全部的不适用10 毫升
在液氮中快速冷冻 1 mL 等分试样，并在 -80°C 下储存长达两年。

15.0.5 N NaOH + 1 mM EDTA 溶液
试剂最终浓度数量
氢氧化钠
乙二胺四乙酸0.5牛
1毫米20 克
0.29 克
ddH 2 O不适用~1,000 毫升
全部的不适用1000 毫升
如裂解缓冲液中所述过滤和脱气缓冲液。将缓冲液在 4°C 下保存长达一年。

16.DEPC处理过的H 2 O
试剂最终浓度数量
0.1% DEPC0.0001% (v/v)1毫升
ddH 2 O不适用999 毫升
全部的不适用1,000 毫升
a.在室温下搅拌溶液 1 小时。
b.高压灭菌 15 分钟。
c.将溶液储存在室温下。

17.10 × IVT 缓冲器
试剂最终浓度数量
特里斯
MgCl 2六水合物
海卫 X-100
亚精胺500 毫米
300 毫米
0.1%
20毫米3.05 克
3.05 克
50微升_
145 毫克
DEPC处理过的H 2 O不适用~45 毫升
全部的不适用50 毫升
a.Aquet液体清洁剂清洁搅拌棒、玻璃烧杯和 pH 计探头。用 ddH 2 O 冲洗干净，然后用 DEPC 处理的 H 2 O。
b.用 HCl 将 pH 值调节至 8。用 0.22- μm注射器过滤器对溶液进行消毒。在- 80 °C 下以 1 mL 等分试样储存长达两年。

18.50% PEG 2000
试剂最终浓度数量
PEG 200050% (w/v)5克
DEPC处理过的H 2 O不适用~6 毫升
全部的不适用10 毫升
μm注射器过滤器对溶液进行消毒。在- 80 °C 下以 1 mL 等分试样储存长达两年。

19.25 毫米 NTP 混合物
试剂最终浓度数量
特里斯
三磷酸腺苷
UTP
CTP
GTP20毫米
25毫米
25毫米
25毫米
25毫米0.12 克
0.69 克
0.69 克
0.66 克
0.66 克
DEPC处理过的H 2 O不适用~48 毫升
全部的不适用50 毫升
a.Aquet液体清洁剂清洁搅拌棒、玻璃烧杯和 pH 计探头。用 ddH 2 O 冲洗干净，然后用 DEPC 处理的 H 2 O。
b.用 HCl 将 pH 值调节至 7。用 0.22- μm注射器过滤器对溶液进行消毒。在- 80 °C 下以 1 mL 等分试样储存长达两年。

20.1 M DTT
试剂最终浓度数量
数字地面电视1M1.54 克
DEPC处理过的H 2 O不适用10 毫升
全部的不适用10 毫升
μm注射器过滤器对溶液进行消毒。在- 80 °C 下以 1 mL 等分试样储存长达两年。

21.0.5 M EDTA
试剂最终浓度数量
乙二胺四乙酸0.5M14.6 克
ddH 2 O不适用100 毫升
全部的不适用100 毫升
用 NaOH 将 pH 值调节至 8.5。用 0.22- μm注射器过滤器对溶液进行消毒。在室温下储存。

22.2 × STOP 解决方案
试剂最终浓度数量
甲酰胺
溴酚蓝
二甲苯氰
0.5 M EDTA95% (v/v)
0.05% (w/v)
0.05% (w/v)
20毫米38 毫升
0.02 克
0.02 克
1.6 毫升
全部的不适用40 毫升
- 20°C 下以 1-mL 等分试样储存长达两年。

23.尿素-PAGE预混料
试剂最终浓度数量
尿素
40% 聚丙烯酰胺
5 × TBE7 米
10% (v/v)
0.5105 克
62.5 毫升
25 毫升
ddH 2 O不适用82.5 毫升
全部的不适用250 毫升
在 4°C 下储存长达一个月。

24.20% APS
试剂最终浓度数量
APS20%0.2克
ddH 2 O不适用1毫升
全部的不适用1毫升
在 4°C 下储存长达一周。

25.1 毫克/毫升糖原
试剂最终浓度数量
糖原1毫克/毫升1毫克
DEPC处理过的H 2 O不适用1毫升
全部的不适用1毫升
- 20°C 下以 1-mL 等分试样储存长达两年。

26.RNA溶解缓冲液
试剂最终浓度数量
凝胶过滤缓冲液1 ×10 毫升
MgCl 2六水合物10毫米20毫克
全部的不适用10 毫升
将缓冲液在- 20°C 下保存长达一年。

致谢

这项工作由生物制药转化创新计划-技术支撑平台轴（ https://tspa.sinica.edu.tw，授权号 AS-KPQ-106-TSPA ）和中央研究院（ https://www .sinica.edu.tw )。两位资助者都没有参与研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备。该协议主要来源于 Huang等人。（2021 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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