材料和试剂

细胞系和寡核苷酸
1.R1/E (129S1/X1) 鼠胚胎干细胞 (ESC)
2.鼠胚胎饲养 (MEF) 细胞（由野生型小鼠制备）
3.Top10 化学感受态大肠杆菌（内部生产（转化效率：5 × 10 6 ）或市售细胞[例如，XL10-Gold Ultracompetent 细胞（Agilent，目录号：200317）]
4.同源模板 - Ultramer DNA Oligos，2 纳摩尔规模 (IDT)
5.单向导 (sg) RNA 寡核苷酸 - 正向和反向 (Eurofins, 100 µM)
6.qPCR 引物（Eurofins，100 µM）
7.PX458 载体（pSpCas9（BB）-2A-GFP）（ Addgene ，目录号：48138）

材料
1.10 cm 培养皿（Corning，目录号：353003）
2.移液器吸头 - 各种
3.96孔平底板（Corning，目录号：3997）
4.96孔圆底板（Greiner，目录号：6500101）
5.3 mL FACS 管（Falcon，目录号：352063）
6.6孔板（ ThermoFisher Scientific，目录号：140685）
7.100 µm细胞过滤器（ Neolab ，目录号：GF-0061）
8.Lipofectamine 3000转染试剂盒（Invitrogen，目录号：L3000-001）
9.BbsI限制酶（NEB，目录号：R0539L，10 单位/µL）
10.T4 DNA连接酶（ Thermo Fisher Scientific，目录号：EL0011 ）
11.NEB缓冲区2.1（10 × ）（NEB，目录号：B7202S）
12.无菌的无核酸酶水（VWR，目录号：PD092）
13.NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit（ Macherey- Nagel，目录号：7400609.50）
14.SOC 培养基（Life Technologies，目录号：15544034）
15.氨苄青霉素（Gibco，目录号：11593027）
16.LB琼脂（Carl Roth，目录号：X9963）
17.LB（Luria/Miller）培养基（Carl Roth，目录号：X968.3）
18.Miniprep试剂盒（DNA分离试剂盒）（ Macherey- Nagel，目录号：740499.250）
19.丝裂霉素C（MMC）（Sigma-Aldrich，目录号： M4287-5x2mg）
20.DPBS（ ThermoFisher Scientific，目录号：14190144）
21.OptiMEM培养基（ ThermoFisher Scientific，目录号：31985062）
22.蛋白酶K（ ThermoFisher Scientific，目录号：26160）
23.胰蛋白酶-EDTA 0.05%（ ThermoFisher Scientific，目录号：25300-054）
24.DMSO（Carl Roth，目录号：A994.1）
25.DMEM 培养基（Gibco，目录号： 41966-129）
26.Knockout TM DMEM 培养基（Life Technologies，目录号： 10829018）
27.Glutamax（Invitrogen，目录号： 35050061）
28.NEAA （Gibco，目录号： 11140-035）
29.笔/链球菌（Gibco，目录号： 15140-122）
30.胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号： 10270-106） - MEF 细胞培养的定期收费
31.ESC FBS（经过 ESC 培养测试以保持全能性）
32.β-巯基乙醇（ Thermo Fisher，目录号： 31350010）
33.LIF/ESGRO （Millipore，目录号： ESG1107）
34.EDTA（Carl Roth，目录号：8043.1）
35.氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：3957.2）
36.Tris（Carl Roth，目录号：AE15.2）
37.1 × SYBR TM Safe DNA Gel Stain（ ThermoFisher Scientific，目录号：S33102）
38.溴化乙锭溶液0.07％（ PanReac AppliChem，目录号：1239-45-8）
39.甘油（Carl Roth，目录号：4043.3）
40.十二烷基硫酸钠（SDS）（Carl Roth，目录号：2326.2）
41.溴酚蓝（Sigma-Aldrich，115-39-9）
42.二甲苯氰（Sigma-Aldrich，2650-17-1）
43.10 ×退火缓冲液（见配方）
44.MEF 培养基（见配方）
45.ESC 培养基（见配方）
46.2 × MEF 冷冻培养基（见配方）
47.2 × ESC 冷冻培养基（见配方）
48.10 × MMC 库存（见食谱）
49.10 × DNA 上样缓冲液（参见配方）

设备

1.显微镜（Carl Zeiss TM ， Axiovert 40 CFL，配备Zeiss TM A-Plan 2.5X/0.06 物镜和Zeiss TM E-PI 10x/20 目镜）
2.荧光显微镜（Life Technologies，EVOS FL）
3.Vortex（Merck，Vortex Genie 2，目录号： Z258423-1EA）
4.凝胶成像系统/紫外透照仪 (INTAS)
5.Nanodrop TM 2000 ( ThermoFisher Scientific, ND-2000)
6.微量移液器（Eppendorf，可变容量）
7.多通道微量移液器（Eppendorf，可变容量）
8.台式冷却离心机（Eppendorf，5417R）
9.无菌工作台（ Thermofisher Scientific、 HERASafe KS/Telstar、Telstar Bio II A）
10.LightCycler ®实时荧光定量 PCR 仪（Roche， LightCycler 480 II）
11.高压灭菌器（各种）
12.细胞分选仪（ MoFlo 、 Cytomation 、Summit 4.3 软件）
13.电泳室（Carl Roth，Midi）
14.电泳电源（Sigma-Aldrich，Consort EV243）

软件

1.MoFlo ®计算机软件（Summit 4.3 软件，Beckman Coulter）； FlowJo (BD)
2.LightCycler ® 480 软件 ( https://lifescience.roche.com/en_de/products/lightcycler14301-480-software-version-15.html )
3.CRISPR-Cas9 引导设计软件，例如BROAD Institute 的CRISPick （还有许多其他选项可供选择，参见Cui等人， 2018 年）

程序

该协议的总体目标是通过同时引入一个或多个突变甚至可能在同一基因内来操纵小鼠胚胎干细胞 (ESC) 的生殖系。为此，用一种或多种编码 sgRNA 的 CRISPR 质粒转染 ESC，在诱变位点引入双链 DNA 断裂。包含所需突变的同源模板与指南共转染以诱导同源定向修复 (HDR)。之后，生长、分离和筛选源自单细胞的 ESC 克隆，以便对基因组序列进行正确的遗传操作。

A.选择 CRISPR 单向导 RNA (sgRNA) 序列（CRISPR 向导）
使用 CRISPR-Cas9 sgRNA 设计程序在目标基因位点附近找到最佳 spCas9 ( S. pyogenes Cas9) 切割位点和相应的 20 个核苷酸引导序列，例如，来自 Broad 研究所的CRISPick基于Doench及其同事开发的算法(Doench等人，2016 年；桑森等人，2018 年）。重要的是，Cas9 切割位点（位于化脓性链球菌PAM 序列 5'-NGG上游 3 至 4 个碱基对）尽可能靠近突变位点，因为突变效率和切割到-突变距离已被描述（Paquet et al. , 2016）。为了提高 PX458 质粒的 U6 RNA 聚合酶 III 启动子对引导 RNA 的表达，如果20-nt 引导序列尚未以“ G” （Ran等人，2013 年）。对于克隆，必须将引导寡核苷酸（具有BbsI 5'-CACC 粘性末端）和相应的反向互补引导寡核苷酸（具有BbsI 5'-AAAC 粘性末端）退火以获得可以克隆到的双链寡核苷酸PX458载体（pSpCas9 主干）的 BbsI 位点（图 1）。请注意，引导序列不包括 5'-NGG PAM 序列本身。有关详细信息，请参阅Ran等人。（2013 年）。

图1 。指导 RNA 寡核苷酸设计示例取自O'Neill等人。 (2021) ，图 S1，Malt1 外显子 17 靶向。
( Doench et al. , 2016 )鉴定了一个 20 bp 的指导序列 ADDIN EN.CITE ，随后用于设计正向寡核苷酸。一个“额外的 G”（蓝色）被添加到 20-bp 引导序列的 5' 末端，然后是BbsI 5'-CACC 粘性末端（绿色）。反向寡核苷酸是 20 bp 引导序列的互补序列加上与“额外 G（蓝色）”互补的“C”，并具有 5'-AAAC 粘性末端（绿色）。退火的寡核苷酸具有粘性末端突出端（绿色），用于连接到PX458 CRISPR 质粒的 BbsI 位点。

B.ssODN同源模板设计
对于点突变的产生或小插入或缺失的引入，可以使用大约 200 bp 的单链寡脱氧核糖核苷酸( ssODN ) 作为 HDR 的同源模板。这些可以从专门从事高精度 DNA 合成的公司订购。所需的更改应放置在ssODN的中心。如果可能，将 Cas9 引导至目标位点的 PAM 序列应在同源模板序列内进行静默突变，以防止同源模板或成功修饰的目标基因座被 Cas9 定向切割。或者，或者除了 PAM 突变之外，还可以在 20-nt 引导序列中引入沉默突变，这同时有助于突变等位基因特异性 PCR 引物的设计（没有特定数量的沉默突变可以被普遍推荐；在我们手中，四种沉默突变被证明是合适的，如图2 所示）。此外，可以通过静默诱变在同源模板内生成人工限制位点，为筛选 ESC 克隆提供了额外的选择。图2显示了一个示例 HDR 。我们想提一下，对于另一个项目，我们通过使用总长度约为 1,400 bp 的线性双链 DNA 同源模板和位于诱变位点两侧的 700 bp 同源臂实现了成功的靶向（这可能对更大规模的遗传操作有用例如删除或插入更长的 DNA 片段）。

图2 。取自O'Neill等人的同源模板设计示例。（2021 年）。
Malt1 外显子 17 用“反义指南”序列靶向，如图 1 所示。所需的靶向突变以橙色显示。 “CCC”三联体密码子（代表“GGG”PAM 序列，因为这里使用了反义向导）（灰色）不能被静默突变。相反，插入了沉默突变（蓝色）以防止 sgRNA 与同源模板结合。为了比较，上面显示了同源区的野生型序列，灰色的“GGG”PAM 和框表示的 20-nt 指导序列。野生型序列中的近似预期切割位点用双线表示。

C.将 CRISPR 引导寡核苷酸克隆到 PX458 质粒中
该协议使用质粒P X458，其中包含一个用于瞬时共表达 SpCas9 和 EGFP 的盒式磁带和一个可将定制设计的 CRISPR 引导寡核苷酸连接到其中以生成在 U6 控制下表达的单个引导序列的盒式磁带RNA 聚合酶 III 启动子（ Ran等人，2013 年）。当转染到 ESC 中时， P X458 引导结构会导致 sgRNA、Cas9 和 EGFP 的表达。 EGFP 阳性 ESC 可以通过 FACS 进行富集，用于在饲养细胞上进一步培养和单个ESC克隆的生长。

1.退火正向和反向 sgRNA 寡核苷酸。通过混合设置退火反应：
感觉引导寡核苷酸 (100 µM)2 µL
反义引导寡核苷酸 (100 µM)2 µL
退火缓冲液 (10 × )2 µL
水（无核酸酶）14 µL

在加热块中将混合物加热至 95°C 5 分钟。关闭加热块，让混合物冷却至室温（约 3 小时）。在无核酸酶水中稀释退火寡核苷酸 1:400。
2.PX458向量以进行引导插入。设置以下限制性消化反应：
PX4582微克
NEB 2.1 缓冲区 (10 × )2 µL
BbsI (10 单位/µL)1.5µL
水（无核酸酶）总共加到 20 µL

在加热块上在 37°C 下孵育 1 小时。将限制反应与 2 µL 10 × DNA 上样缓冲液混合，并在 1% 琼脂糖凝胶（含有 0.5 µg/mL 溴化乙锭或 1 × SYBR TM Safe DNA Gel Stain）上以 120 V 分离 1 小时。切出线性化的 PX458 载体片段 (9,270 bp)，用凝胶纯化试剂盒纯化，并在Nanodrop TM上测量浓度。
3.将退火的寡核苷酸（来自步骤 1；1:400 稀释 = 25 nM ）连接到 PX458 载体（来自步骤 2）中。设置以下连接组合：
PX458（线性化）100 纳克
退火引导寡核苷酸 (25 nM )2 µL
T4 连接酶 (5 单位/µL)2 µL
T4 连接酶缓冲液 (5 × )2 µL
水（无核酸酶）总共加到 10 µL

在室温下孵育连接混合物 15 分钟。
4.为了转化为大肠杆菌，将 2 μL 的结扎 sgRNA 指南（从步骤 3）添加到 25 μL 化学感受态大肠杆菌。混合物在冰上孵育 5 分钟，42°C 热休克 40 秒，然后置于冰上 5 分钟。将大肠杆菌与 150 µL 不含抗生素的 SOC 培养基混合，并在 37°C 下孵育 1 小时。将总细胞体积涂抹在含有氨苄青霉素的 LB 板上，并在 37°C 下孵育过夜。选择菌落并接种到 5 mL 含有氨苄青霉素的 LB 培养基中，并在 37°C 和 180 rpm 下生长过夜。使用 DNA 分离试剂盒分离质粒 DNA，并通过Nanodrop TM量化 DNA 。在对正确的引导插入进行测序验证后，PX458 CRISPR 引导质粒可用于转染到鼠 ESC 中，以共表达 sgRNA 和 Cas9，并以 EGFP 作为报告基因，通过流式细胞仪细胞分选成功转染和富集。

D.小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 的制备和培养
ESC 需要在一层小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 上培养，MEF 作为饲养细胞。 MEFs 由 12.5 dpc （性交后天数）野生型小鼠胚胎产生，可以传代四次，然后通过丝裂霉素 C (MMC) 处理抑制生长，这样它们就可以作为 ESC 培养的饲养细胞。
1.收获 MEF
在第 12.5 天从野生型小鼠胚胎中制备小鼠 MEF 细胞。简而言之，在含有 PBS 的细胞培养皿中，将每个胚胎与卵黄囊分开，取出并丢弃头部和肝脏。随后，分别处理每个胚胎：将剩余的组织通过 100 µm 筛网筛入 MEF 培养基中，并将一个胚胎的细胞转移到 6 厘米的细胞培养皿中。让 MEF 细胞在一夜之间生长。第二天，洗去未贴壁的死细胞，让细胞进一步生长直至汇合（大约 2 天）。
2.传代 MEF
通过用 PBS 洗涤细胞、加入 2 mL 胰蛋白酶并在 37°C 下孵育 5 分钟，从 6 cm 培养皿表面分离粘附的 MEF 细胞。通过添加 MEF 培养基停止胰蛋白酶化。将收获的 MEF 从 6 厘米的盘子转移到一个 15 厘米的盘子上，让其在培养箱中生长。汇合后，从 15 厘米板（使用 8 毫升胰蛋白酶）到四个 15 厘米的盘子进行第二次通道。 MEF 细胞现在可以在液氮中冷冻（参见步骤 3）或用丝裂霉素 C (MMC) 处理以用于 ESC 培养（参见步骤 4）。
3.冷冻和解冻 MEF
从一个汇合的 15 厘米培养皿（约 2 × 10 7 个细胞）中收获 MEF。将收获的细胞放入 2 mL 的 MEF 培养基中并放在冰上。加入 2 mL 冰冷的 2 ×冷冻培养基 (1:1) 并将 1 mL 等分试样（包含约 5 × 10 6 个细胞）转移到冷冻小瓶中，将其放入聚苯乙烯泡沫塑料盒中，在 -80 °C 冰箱。 24 小时后，将冷冻细胞转移到液氮中进行长期储存。解冻时，将冷冻小瓶漂浮在 37°C 水浴中，然后将解冻的细胞悬液转移到 10 mL 的 PBS 中。 350离心机 × g 5 分钟，将细胞沉淀放入 10 mL MEF 培养基中，将细胞分布到 4 个 10 cm 培养皿中，并在 37°C/5% CO 2下孵育。要么让细胞生长 2 天以进一步传代，要么在第二天使用 MMC 治疗（参见步骤 4）。
4.用丝裂霉素 (MMC) 治疗 MEF
用作 MMC 处理的饲养细胞层的 MEF 细胞密度为每 10 cm 培养皿2.5 × 10 6 个细胞。用 MMC（MEF 培养基中 10 µg/mL）处理 MEF 细胞，并在 37°C 下孵育 2 至 3 小时以抑制进一步增殖。去除含有 MMC 的培养基，用 PBS 彻底清洗细胞 3 次，然后加入新鲜的 MEF 培养基。经 MCC 处理的 MEF 现在可用作 ESC 生长的基础层（并且应在 MMC 处理后的 2 天内使用）。

E.ESC 培养（R1/E 细胞）
胚胎干细胞必须在允许维持全能性的条件下培养。为此，ESCs 在一层饲养细胞上培养，并且必须在含有 FBS 的 ESC 培养基中保持适当的细胞密度，该培养基已被批准用于 ESC 培养（可以从商业来源购买或从专门从事 ESC 培养的实验室获得）。鼠 R1/E ESC 总是在 MMC 处理的 MEF 的汇合（但不太密集）饲养层上生长（大约 40,000 个饲养细胞/cm 2 ）。
1.在 ESC 培养基中的饲养细胞上每 cm 2播种大约 30,000 个 R1/E ESC。每天更换培养基，并且 ESC 通常在培养 2 天后以适当的细胞密度和形态分裂：当 ESC 形成许多具有锋利边缘的不同菌落时，达到这种条件，这些菌落共同覆盖了培养皿表面的大约三分之一不相互接触（图 3）。对于分裂，用 PBS 洗涤 ESC 并用胰蛋白酶处理 5 分钟，通过添加 ESC 培养基使胰蛋白酶失活。通过用电动移液器强力移液获得单细胞悬液：将细胞悬液吸入 10 mL 移液管中，将移液器的尖端压在细胞培养皿的底部，然后将细胞悬液从移液管中挤出。重复此操作 10 次。在新鲜的饲养细胞上计数细胞并接种 30,000 个细胞/cm 2 。根据一些经验，可能不必总是计数 ESC，并且在显微镜下目视检查细胞后，可以估计可接受的分裂因子，对于 ESC 在最佳生长条件和细胞密度下通常为 1:6（a 1:6 的分割因子意味着从细胞培养板中收获细胞，并将 1/6 的细胞转移到相同格式的新细胞培养板中）。

图3 。 R1/E ESC 的形态。
R1/E 细胞形成不同的菌落并覆盖大约三分之一的板表面。

2.胚胎干细胞可以在液氮中冷冻：为此，胚胎干细胞如上所述被胰蛋白酶消化，细胞被计数，以350 ×g的速度旋转，在胚胎干细胞培养基中调整为5 × 10 6 个细胞/mL，并在冰上短暂预冷。加入等体积的冰冷 2 × ESC 冷冻培养基，混合后，将 1 mL 细胞悬浮液分配到冷冻管中，在聚苯乙烯泡沫塑料盒内于 -80°C 下冷冻，然后转移到液氮中。稍后解冻时，将冷冻小瓶置于 37°C 水浴中，当内容物为液体时，将细胞转移到 15 mL 管中的 10 mL PBS 中，以 350 × g旋转，取出细胞沉淀在 ESC 培养基中。将来自每个冷冻管的细胞（2.5 × 10 6 个细胞）接种到 10 cm 培养皿中的饲养细胞上。

F.胚胎干细胞的转染
报告的协议通常使用电穿孔转染带有质粒和同源模板的 ESC。电穿孔需要大量的 DNA (20 µg) 以及许多细胞（通常在 10 cm 培养皿中生长大约 5 × 10 6 个细胞），并且由于电穿孔条件恶劣，许多细胞会死亡。脂质转染被证明更温和，允许使用更少的细胞数量（200,000 个细胞在 6 孔板中生长）和更少量的 DNA（2 µg 或更少）。根据流式细胞仪中 EGFP 阳性细胞的百分比测量，这导致大约 5% 的转染效率，而在荧光显微镜下只能看到一小部分具有高 EGFP 表达的转染细胞（图 4）。根据制造商的方案，通过 Lipofectamine 3000 试剂盒使用 lipofection 以 6 孔格式进行 ESC 转染。
1.在转染前大约 16 小时，在 2 mL 的 ESC 培养基（在饲养细胞上）中的 6 孔板的每孔中播种 200,000 个 ESC。
2.在转染当天，在管 A 和管 B 中制备混合物：
A 管：125 µL OptiMEM培养基 + 5 µL Lipofectamine 3000 试剂。
管 B：125 µL OptiMEM培养基 + 6 µL P3000 试剂 + 6 µg DNA（PX458 质粒和同源模板，均匀分布至最大总 DNA 量 6 µg）。
3.将管 A 和 B 的内容物混合在一起，在室温下孵育 15 分钟。
4.将整个转染量转移到 6 孔中的 ESC（步骤 1）。
5.将 ESC 与 DNA-脂质体复合物一起孵育 6 小时。
6.孵育后，用新鲜的 ESC 培养基更换培养基，让细胞在培养箱中生长 24 小时，然后通过 FACS 对 EGFP 阳性细胞进行分类。

G.基于 FACS 的 ESC 细胞分选和单克隆 ESC 克隆生长
成功转染的 ESC 表达由 PX458 质粒编码的 EGFP，因此可以通过 FACS 富集到 95% 以上（图 4B）。只需将 2000 个分类的 EGFP 阳性 ESC 接种到 10 厘米培养皿的饲养层上，即可生长多达 100 个 ESC 克隆。与使用带有抗生素抗性盒的 DNA 构建体进行选择的经典方案相比，FACS 分选的 ESC 不需要用抗生素处理，因此 ESC 板不包含培养中的数百万垂死细胞，这必须小心冲走。单克隆 ESC 克隆通过每隔一天更换的 ESC 培养基生长，并在 7 天内准备好采摘，这比使用电穿孔和抗生素选择的经典方案快大约 2 天。
1.用 PBS清洗 6 孔板（来自程序 F，步骤 6）中的 ESC 1 × 。
2.加入 500 μL 的胰蛋白酶，孵育 5 分钟，加入 500 μL 的 ESC 培养基，上下大力吸管，生成含有 ESC 和饲养细胞的单细胞悬浮液。
3.将细胞悬液转移到新的 6 孔板中。在 1 小时内，大多数饲养细胞但不是 ESC 将重新粘附。轻轻取出 ESC 并转移到 3 mL 管中进行细胞分选。
4.使用配备 100 μm 喷嘴的细胞分选机，将 EGFP 阳性 ESC 分类到 ESC 培养基中。将 2000 个分选的细胞放在一个 10 厘米的盘子上，该盘子预先铺有 3 × 10 6 MMC 处理的 MEF 细胞，并允许细胞生长约 7 天，每隔一天更换一次培养基（图 5A）。预计每 10 cm 培养皿最多可生长 100 个 ESC 菌落。因此，建议每个条件播种 10 个 10 厘米的培养皿，以获得足够数量的菌落进行筛选（我们建议筛选大约 500 个菌落）。

图4 。用 PX458 脂转染 24 小时后的 ESC。
(A) 在荧光显微镜下看到的具有高 EGFP 表达的细胞。 (B) 与未转染的细胞 (灰色曲线)相比, 流式细胞术可以灵敏地检测具有低至中等 EGFP 表达 (黑色曲线) 的 ESC 。细胞分选导致表达 EGFP 的细胞富集到 95% 以上（绿色曲线）。

H.选择 ESC 克隆
当不同的 3 维菌落在 10 厘米板上生长并在显微镜下可以看到时，可以在细胞分选后大约 7 天挑选单克隆 ESC 克隆（图 5A）。
1.在采摘菌落之前，在 100 μL 的 ESC 培养基（每孔约 10,000 个细胞）中播种 2 个带有 MMC 处理的 MEF 细胞的平底 96 孔板。将盘子放在培养箱中，直到需要。
2.用 10 mL 的 PBS 清洗含有 ESC 菌落的 10 厘米盘子，并在盘子中加入 10 mL 的新鲜 PBS。
3.将显微镜放在无菌工作台下，以可视化单个 ESC 菌落（图 5B）。确保有足够的空间使用 100 μL 移液器从侧面接近板。用移液器吸头轻轻地将每个菌落从表面移开并将其拉起，从而将每个菌落与饲养层分离在 50 µL 的体积中。应小心提取整个 ESC 菌落，以避免 ESC 分布到板上，从而避免其他单克隆菌落的交叉污染。

图5 。细胞采摘工作流程和设置。
(A) 来自细胞分选的 EGFP 阳性细胞以每 10 厘米培养皿 2000 个细胞的密度镀在一层 MMC 处理的 MEF 细胞上。在 7 天的生长期后，可以从每个 10 cm 培养皿中挑取 50 – 100 个单克隆 ESC 克隆到重复的 96 孔板中，分别用于冷冻或 qPCR 筛选。 (B) 在无菌细胞培养罩下进行克隆采摘的显微镜设置。

4.将挑选的菌落转移到圆底 96 孔板中。挑选 96 个克隆来填充板和筛选所需的尽可能多的板（我们通常选择五个 96 孔板）。尽快进行第 5 步（建议协同工作：一个人采摘，另一个人处理采摘的克隆）。
5.收集 96 个菌落后，在每个圆底 96 孔中加入 30 µL 胰蛋白酶，其中含有挑选的 ESC 克隆，并在 37°C 下孵育板 10 分钟。在每口井中加入 100 μL 的 ESC 培养基以停止胰蛋白酶化。
6.使用多通道微量移液器，在每个孔中用力上下移液，将 ESC 克隆聚集体分离成单个细胞，并将每个孔的内容物分成两个含有 MEF 细胞的平底板（在步骤 1 中准备）。将两个板孵育 2 天。板 #1 用于筛选，板 #2 被冷冻，以便以后回收通过 qPCR 筛选和序列分析鉴定的阳性克隆。
7.在 96 孔板中冷冻 ESC 之前，检查每个 96 孔以判断细胞密度并记录解冻时应接种的细胞培养板格式（这可以通过 1 :6 拆分因子，如程序 E 步骤 1) 中所述。对于在 96 孔板中冷冻 ESC，在板 #2（从步骤 6 开始）中用 PBS洗涤细胞 1倍，通过每孔添加 30 µL胰蛋白酶对细胞进行胰蛋白酶消化，在培养箱中孵育 5 分钟，与 70 µL ESC 混合培养基停止胰蛋白酶化反应，用移液管用力重悬细胞。将板在冰上短暂预冷，然后加入 100 µL 冰冷的 2 × ESC 冷冻培养基，在 -80°C 的聚苯乙烯泡沫塑料盒内混合和冷冻板，然后转移到液氮中。对于 96 孔板中的细胞解冻，将板在 37°C 培养箱中解冻，将所需克隆转移到 5 mL 培养基中的 15 mL Falcon 管中，以 350 × g离心细胞，吸出上清液，洗涤细胞一次用 1 mL 的 PBS，将细胞吸收到 100 μL 的 ESC 培养基中，然后转移到足够的培养基（通常是 48 或 24 孔格式）中适当的孔大小。

I.qPCR 筛选正确靶向的 ESC 克隆
建议在项目一开始就建立特定和敏感的 qPCR 协议，作为同源模板设计的一部分，因为通过完善的筛选策略可以识别正确操作的 ESC 克隆至关重要。在正确插入同源模板后，合成与基因组位点相对应的 DNA 模板可能是有价值的，它可以作为突变位点特异性和灵敏扩增的阳性对照。如果在建立 PCR 条件时加入来自野生型 ESC 的基因组 DNA（如以下步骤 1 至 3 所述制备），则可以更好地模拟筛选条件。测试将阳性对照模板连续稀释至拷贝数 1。可检测到的 10 个阳性对照模板的扩增通常足够灵敏，以后能够通过筛选 ESC 克隆的基因组 DNA 来检测阳性 ESC 克隆。为防止筛选过程中出现假阳性信号，请注意避免“阳性对照”DNA 片段或阳性筛选扩增子污染工作场所和设备；阳性对照 DNA 或扩增子绝不应在协议的后续步骤（ESC 培养、转染、克隆挑选和筛选 PCR）进行处理。
1.要从板 #1（来自程序 H 步骤 6）制备 ESC 克隆的基因组 DNA 用于 qPCR 筛选，请从 96 孔板中取出培养基，用 PBS 洗涤细胞一次，然后向每个孔中加入 200 µL无核酸酶水好。在 96 孔 PCR 循环仪中，将板在 95°C 下孵育 15 分钟。
2.将蛋白酶 K 添加到每个孔中，最终浓度为 200 µg/mL，并在 55°C 下孵育 90 分钟以进行蛋白质消化。将板加热至 95°C 15 分钟以灭活蛋白酶 K。样品现已准备好进行筛选。
3.设计 PCR 筛选引物，专门用于扩增正确靶向的序列，以识别成功操作的 ESC 克隆。在定点诱变的情况下，一个 PCR 引物应该是突变特异性的，覆盖突变位点（根据程序 B 中描述的同源模板设计），另一个引物应该位于同源模板序列之外。例如，参见O'Neill等人的图 S1B。（2021 年）。在 qPCR 期间，潜在的阳性克隆将以较低的循环阈值 (Ct) 值扩增。如果在一个 ESC 克隆中插入多个突变，则需要为每个突变位点设计 qPCR 协议和突变特异性引物，并且每个 qPCR 筛选都需要单独进行。
4.根据您建立的协议执行 qPCR。大多数基因组 ESC DNA 样本很可能会产生高 Ct 值 (>35) 的背景信号，具体取决于 PCR 协议的特异性。然而，样本子集会在低得多的 Ct 值下产生稳健的扩增（图 6）。这些克隆是具有基因组修饰的候选者，需要通过测序进一步分析（O'Neill等人，2021，图 S1C，D）。

图6 。通过 qPCR 筛选 ESC。
使用仅扩增正确突变的靶序列的突变特异性引物筛选克隆。阴性克隆（黑色曲线）由于其高阈值循环 (Ct) 值而被排除在外。潜在的阳性克隆（灰色/红色曲线）具有较低的 Ct 值。通过测序（可能与 TOPO 克隆结合）验证预期阳性克隆，以找到正确插入所有突变的克隆（红色曲线）。

5.对于测序，感兴趣的基因组区域用目标位点侧翼的引物进行扩增。纯化后的 PCR 产物可直接用于测序。测序数据通常很难解释，因为目标基因的两个等位基因可以不同地改变，产生两个重叠的色谱图，不能明确地分配给一个或另一个等位基因。如果使用在线工具，例如 CRISPID (Dehairs et al. , 2016)，甚至会出现这种情况。在这种情况下，阐明不同等位基因序列状态的可靠技术是上述 PCR 产物的 TOPO 克隆。 TOPO 克隆产生仅携带一个或另一个等位基因片段的大肠杆菌克隆，然后可以单独对其进行测序。
6.具有确认基因组修饰的 ESC 克隆可以通过从板 #2 中解冻来恢复（参见程序 H，步骤 6 和步骤 7），并且应以健康生长和良好ESC形态为特征。选定的 ESC 克隆在几个等分试样中进行扩展和冷冻，现在可以用于胚胎注射，以创建嵌合小鼠和随后的种系传递。

食谱

1.10 ×退火缓冲液
10 毫米三
1 毫米乙二胺四乙酸
50 毫米氯化钠
酸碱度 7.5
2.MEF 培养基
500 毫升 DMEM
50 mL FBS（常规）
500 µL 50 mM β-巯基乙醇
5 毫升的 NEAA
5 毫升笔/链球菌
3.ESC培养基
500 毫升的Knockout TM 记忆体
90 mL FBS（经 ESC 培养测试）
1.2 mL 50 mM β-巯基乙醇
6 毫升的 NEAA
6 毫升谷氨酰胺
6 毫升笔/链球菌
90 µL LIF/ESGRO ( 1,500 U/mL)
4.2 × MEF 冷冻培养基
20% 二甲基亚砜
30% FBS（常规）
50% DMEM（含 1% 笔/链球菌）
5.2 × ESC 冷冻培养基
20% 二甲基亚砜
30% FBS（ESC 培养测试）
50% DMEM（含 1% 笔/链球菌）
6.10× MMC 库存
将 MMC 粉末溶解在 MEF 培养基中，储备浓度为 100 µg/mL，无菌过滤，并储存在 4°C
7.10× DNA 上样缓冲液
34% 甘油
0.5% SDS
10 毫米乙二胺四乙酸
2.5 毫克/毫升溴酚蓝
2.5 毫克/毫升二甲苯氰

致谢

该协议首次用于《科学免疫学》的出版物中（奥尼尔等人，2021 年）。这项工作得到了 Deutsche Forschungsgemeinschaft (ID 210592381 – SFB 1054 A04, ID 360372040 – SFB 1335 P07) 和 Deutsche Krebshilfe (No. 70112622) 的支持。 DK 是波士顿 Monopteros Therapeutics Inc. 的科学顾问。

伦理

用于从 12.5 dpc胚胎中产生小鼠胚胎成纤维细胞的怀孕小鼠按照欧洲实验动物科学协会联合会的指导方针进行饲养和处理。

参考

1.科恩，J. (2016)。任何白痴都可以做到。基因组编辑器 CRISPR 可以让突变小鼠触手可及。科学。 https://www.science.org/content/article/any-idiot-can-do-it-genome-editor-crispr-could-put-mutant-mice-everyones-reach 。
2.Cui, Y.、Xu, J.、Cheng, M.、Liao, X. 和 Peng, S. (2018)。审查 CRISPR/Cas9 sgRNA 设计工具。跨学科科学10（2）：455-465。
3.Dehairs, J.、 Talebi , A.、 Cherifi , Y. 和Swinnen , JV (2016)。 CRISP-ID：通过 Sanger 测序解码 CRISPR 介导的插入缺失。科学代表6：28973。
4.Doench ，JG， Fusi ，N.， Sullender ，M.，Hegde，M.， Vaimberg ，EW，Donovan，KF，Smith，I.， Tothova ，Z.，Wilen，C.，Orchard，R.，等。（2016 年）。优化的 sgRNA 设计以最大限度地提高活性并最大限度地减少 CRISPR-Cas9 的脱靶效应。 Nat Biotechnol 34（2）：184-191。
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6.Hall, B., Cho, A., Limaye, A., Cho, K., Khillan , J. 和 Kulkarni, AB (2018)。使用 CRISPR/Cas9 技术对小鼠进行基因组编辑。电流原始细胞生物学81（1）：e57。
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