材料和试剂

细胞
1. Leishmania tarentolae UC 菌株（ATTC ® ，目录号：PRA-229 TM ）
2. 克氏锥虫Y菌株，由 Marcelo Sousa Silva（ Universidae Nova de Lisbo ， Lisboa ，葡萄牙）和 João Aristeu da Rosa（生物科学部， Araraquara ，巴西）提供（ Rimoldi Ribeiro等，2018）

细胞的生长
1. Difco TM肝输液肉汤（BD Bioscience，目录号：226920）
2. 巴克托胰蛋白（BD Bioscience，目录号：211713）
3. 氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
4. 磷酸氢二钠（Sigma-Aldrich，目录号：53264）
5. 氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
6. 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
7. Hemin（Sigma-Aldrich，目录号：H9039）
8. 热灭活（ Dutscher Dominique，目录号：702780）
9. 脑心浸液肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：53286）
10. 青霉素/链霉素10,000 U/mL（ Gibco TM ，目录号：15140-122）
11. LIT 培养基（见食谱）
12. 1.25 mg/mL Hemin 溶液（见配方）
13. BHI 培养基（见食谱）

线粒体纯化
1. 38 -mL 超透明管（Beckman Coulter，型号：344058 或同等产品）
2. 50-mL Falcon TM管
3. 1.5-mL Eppendorf Safe-Lock 管
4. 山梨糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
5. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：16104-2）
6. 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
7. 氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
8. Tris（Sigma-Aldrich，目录号：10708976001）
9. 盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
10. 氯化镁 (MgCl 2 · 6H 2 O) （Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
11. Histodenz TM （Sigma-Aldrich，目录号：D2158）
12. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
13. 来自牛胰腺的 DNase I，II 级（Roche，目录号：10104159001）
14. 磷酸二氢钠一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S9638）
15. 磷酸氢二钠七水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S9390）
16. Tris-HCl pH 7.5（Sigma-Aldrich，目录号：T2319）
17. Tris-HCl pH 8（Sigma-Aldrich，目录号：T2694）
18. 氮气瓶
19. 磷酸盐缓冲液 pH 7.9（见配方）
20. 洗涤缓冲液（见配方）
21. SoTE缓冲液（见配方）
22. SoTE -EDTA 缓冲液（参见配方）
23. SoTM缓冲液（见配方）
24. 不连续 L. tarentolae的Histodenz TM梯度（见食谱）
25. 不连续用于T. cruzi的Histodenz TM梯度（见食谱）

核糖体纯化
1. HEPES-KOH（ Euromedex ，目录号：10-110-C）
2. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
3. 六水氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
4. 氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
5. n-十二烷基β -D-麦芽糖苷：DDM（Sigma-Aldrich，目录号：D4641）
6. 完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：11873580001）
7. DL-二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
8. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903）
9. HEPES-KOH pH 7.6（见食谱）
10. 线粒体裂解缓冲液（参见食谱）
11. 单体缓冲液（见食谱）
12. 40% 蔗糖垫（见食谱）
13. 10 – 30% 蔗糖梯度（见食谱）

设备

细胞的生长
1. PSM HeraSafe KS12 ( Thermo 科学TM ，目录号：15227966）
2. Innova ® -42 培养箱摇床（Eppendorf，New Brunswick TM ，目录号：M13350012）
3. 无菌 5-L Erlenmeyer（DURAN ® ，目录号： 212167307）具有硅胶海绵封口（Sigma-Aldrich，目录号：C1046）
4. Malassez计数池（Sigma-Aldrich，目录号：BR719005）

线粒体纯化
1. 45-mL Cell Disruption Bombs（Parr Instrument Co.，目录号：16-6950）
2. 离心机（Beckman-coulter，型号：Avanti j-26XP 或同等产品）能够采用 4 × 1 L的定角转子。
3. 定角转子 4 × 1 L（Beckman-coulter，型号：JLA9.1 或同等产品）
4. 4 × 1-L 离心瓶（Beckman-coulter，型号：1L Bottle Assy，J-Lite，PP，95 × 191 mm，部件号：A98813）
5. 固定角转子 12 × 39-mL（Beckman Coulter，型号：50.2 Ti或同等产品）
6. 26.3-mL 离心瓶（Beckman Coulter，型号：355654 或同等产品）
7. KIMBLE ® Dounce 组织研磨机，15 mL（Sigma-Aldrich，目录号：D9938）
8. 50-mL 离心机（Sigma，型号：3-18KS 或同等产品）
9. 10-mL注射器（ Terumo TM ，目录号： 8SS10S21381 ）
10. 皮下注射针N°25（ Terumo TM ，目录号：8AN1925R1）
11. 超速离心机（Beckman Coulter，型号：OPTIMA L80XP 或同等产品），可接 SW28 转子
12. 摆动转子 6 × 38-mL（Beckman Coulter，型号：SW28 或同等产品）
13. 用于 1.5-mL 管的微量离心机（Eppendorf：5425R，目录号：5405000158）

核糖体纯化
1. Gradient master 108（ BioComp Instruments，目录号：108）
2. 活塞梯度分馏器（ BioComp Instruments，目录号：152）
3. 超速离心机（ ThermoFisher Scientific，型号： Sorvall TM WX，或同等产品，目录号：15362177），能够带 TH-641 管
4. 摆动转子 6 × 13-mL（ ThermoFisher Scientific，型号：TH-641 或同等产品，目录号：12161690）
5. TH-641 管：13.2-mL，开顶polyclear TM离心管（Seton Scientific，目录号：7030）
6. 超速离心机（Beckman Coulter，型号：OPTIMA MAX XP 或同等产品），能够使用 TLA 110 转子
7. 固定角转子 6 × 4-mL（Beckman Coulter，型号：TLA110.3 或同等产品）
8. TLA110.3 管：3.5 -mL，开口厚壁聚丙烯管（Beckman Coulter，目录号：349623）
9. 用于 1.5-mL 管的旋转轮（IKA TM ，目录号：0004016000）
10. KIMBLE ® Dounce 组织研磨机，2 mL（Sigma-Aldrich，目录号：D8938）

核糖体冷冻网格制备和数据收集
1. Quantifoils R2/2 EM 网格（Electron Microscopy Sciences，目录号：Q210CR2）
2. 冷冻网格 TEM 网格盒（Agar Scientific，目录号：AGG3727）
3. Safematic CCU-010 碳涂层机或等效物（Labtech-EM，目录号：100001）
4. 来自 ELMO 或同等产品的辉光放电系统（Agar Scientific，目录号：AGB8958）
5. Thermo Fisher Vitrobot Mark IV 或同等产品

程序

A. 细胞的生长
通过在搅拌下培养寄生虫并在对数后期*收集寄生虫，获得所需的细胞临界质量。
*用于接种的寄生虫的预培养始终保持在对数期，此时细胞密度呈指数增长。
1. 上鞭毛体克氏锥虫
接种 8 × 10 5寄生虫/mL 的LIT 培养基填充四个 5-L Erlen Meyer 中的每一个（5 × 10 7寄生虫/mL的预培养约 16 mL）。在 28°C 下搅拌 (90 rpm) 孵育 7 天。最终预期浓度约为 3 × 10 7寄生虫/mL*。
*使用Malassez计数池计算培养物的最终浓度。
2. 鞭毛体利什曼原虫
接种 1.3 × 10 6寄生虫/mL 的BHI 培养基填充四个 5-L Erlen Meyer 中的每一个（在 5 × 10 7寄生虫/ml下预培养约 26 mL ）。在搅拌 (140 rpm) 下在 26°C 下孵育 2 天。最终预期浓度约为 6 × 10 7寄生虫/ mL。

B. T. cruzi和L. tarentolae线粒体的提取和纯化
该程序基于通过氮气减压、差速离心和使用Histodenz TM梯度纯化线粒体来破坏细胞*。整个过程总共需要一天时间，总结在图 1 中。所有的缓冲液都是在提取线粒体的前一天准备好的，并储存在 4°C。所有仪器均在 4°C 下预冷。
*氮气减压可以在不改变细胞器的情况下完全快速地破坏细胞膜。进行差速离心以从细胞碎片中分离细胞器。使用Histodenz TM阴离子梯度是获得完整线粒体良好产量的最佳方法。 T. cruzi和L. tarentolae的实验步骤是相同的，除了从Histodenz TM梯度恢复的分数不同（见图 1）。

图 1.从T. cruzi和L. tarentolae纯化线粒体和线粒体核糖体的工作流程文化。
(A) 细胞培养； (B) 线粒体纯化： L. tarentolae的不连续Histodenz TM梯度由21.7%/25%28.3%31.6% 相组成，对于T. cruzi由 18%/21%/25%/28% 相组成。线粒体应该出现在 21%/25% Histodenz TM间期（右）和L. tarentolae （左）的25 %/28% Histodenz TM间； (C)核糖体纯化。

1. 在 4°C 的固定角转子中以 11,000 × g离心 10 分钟，在四个 1-L 离心瓶中收获细胞。
2. 用 1 L 洗涤缓冲液洗涤颗粒两次。每次，通过在 4°C 下以 11,000 × g离心 10 分钟并通过轻轻倒置瓶子去除上清液来回收颗粒。
3. 计算出的浓度为 2.5 × 10 9 个细胞/mL*的SoTE缓冲液重新悬浮四个颗粒。
*48 mL SoTE缓冲液用于T. cruzi ，96 ml SoTE缓冲液用于L. tarentolae 。
4. 将所有重新悬浮的颗粒转移到足够数量的 15-mL 玻璃dounce陶器中，并用 5 次冲程将它们均质化*。
*使用Douncers进行氮空化之前的步骤旨在使样品中的寄生虫分布均匀。这是为了避免聚集并优化与氮气的接触。由于重新悬浮寄生虫所需的SoTE体积，需要几个Douncer来执行均质化。
5. 通过氮空化进行细胞破坏。将细胞放入带有磁棒*的压力容器中。将其关闭并用磁力搅拌器置于冰上。连接氮气瓶并注入气体以获得 80 bar 的压力。让细胞在这种条件下搅拌 1 小时。然后打开阀门并在 50 mL Falcon 管上回收被破坏的样品。
*细胞破碎弹可装载的最大体积为 45 mL。因此，有必要多次重复空化步骤，直到整个寄生虫体积都被处理完。在此期间，受干扰的寄生虫可以保持在 4°C。
6. 将这种粗裂解液放在冰上至少 10 分钟，直到细胞碎片沉淀。用血清吸管收集尽可能多的液体（包含线粒体），并将其转移到两个 26.3 毫升的离心瓶中。用 3 mL 的SoTE缓冲液再次清洗沉淀的细胞碎片颗粒，并再次收集液体。重复此步骤，直到泡沫颜色从棕色变为白色*。
*泡沫中含有大量的线粒体，洗涤它可以大大提高线粒体回收率。
7. Ti转子上在 4°C 下以 31,000 × g离心 10 分钟。轻轻丢弃上清液。
8. 用 1 体积的SoTM缓冲液和100 μ g /mL DNAs eI （终浓度）。
9. 使用注射器将提取物通过皮下注射针头 (No.25) 进一步破坏基因组 DNA。
10. 在 4°C 下孵育 30 分钟。在孵育期间重复步骤 B9。
11. 通过添加等量的SoTE - EDTA停止 DNase 处理缓冲。
12. 将提取物转移到 50-mL Falcon 管中，并用SoTE缓冲液补足至 50ml 。
13. 以 555 × g和 4°C 离心 20 分钟。
14. 收集上清液并保持在冰上。
15. 用 15 mL 的SoTE缓冲液重新悬浮颗粒，并使用 15 mL Dounce potter 进行均质化。
16. 转移到 50-mL Falcon 管中，并用SoTE缓冲液完成至 50-mL 。
17. 在 3-18KS 离心机上 4°C以 380 × g离心 10 分钟。
18. 收集上清液。与步骤 B14 的上清液混合。
19. 分布在四个 26.3 毫升的瓶子上。
20. 在固定角转子 50.2Ti 中以 31,000 × g在 4°C 下离心 10 分钟。颗粒含有细胞器。
21. 用总体积为 6 ml 的含有 50% Histodenz TM的SoTE缓冲液重悬细胞器沉淀。
22. 使用 15-mL Dounce potter 5 次冲程均质化重新悬浮的颗粒，
23. 用注射器装载 3ml 注射器（对应于 ~6 至 12 × 10 10细胞当量）将均质溶液置于两个不连续Histodenz TM梯度的底部（21.7%/25%28.3%31.6% 或 18%/21%/25%/28% 用于L.tarentolae提取物或来自T. cruzi ，分别）在 38-mL 超透明管中。
24. 在摆动斗式转子 SW28 上，在 4°C 下以 100,000 × g离心梯度45 分钟。
25. 在此阶段之后，渐变应显示四个带*、** 。
*对于T. cruzi ，线粒体应出现在 21%/25% Histodenz TM间期，对于L. tarentolae ，线粒体应出现在 25%/28% Histodenz TM间期。
**肉眼可见的条带出现在不同Histodenz TM相的界面处（在图 1B 中突出显示）。
26. 通过移液，消除梯度的上部，直到达到感兴趣的波段。然后，从每个梯度中收集 5ml 该条带。
27. 通过添加 4 卷SoTE从过量的Histodentz TM中清洗线粒体缓冲区。倒置混合，并在两个 26.3-mL 瓶上以 33,000 × g和 4°C 离心 15 分钟。
28. SoTE缓冲液恢复每个线粒体颗粒。
29. 转移到两个 1.5-mL Eppendorf 管中，在 10,000 × g和 4°C 下离心 10 分钟。
30. 去除上清液，称重湿线粒体颗粒。总预期量为~700 mg。
31. 将干燥的颗粒在液氮中快速冷冻并储存在-80° C 。

C. 线粒体核糖体的纯化
在该协议的这一部分中， mitoriribosome的纯化涉及裂解冷冻的线粒体，制作蔗糖垫以恢复线粒体复合物，然后是蔗糖梯度以分离不同的高分子量复合物（包括不同形式的核糖体）。前一天准备储备缓冲液，过滤（0.2-µm），并在 4°C 下储存；这些可以保存几个月。当相关时，通过添加 DTT 和/或蛋白酶抑制剂临时确定缓冲液。每一步都在 4°C 下完成。
1. 取从程序 B* 中获得的 3 克冷冻线粒体。用 700 μL裂解缓冲液填充每个 Eppendorf 管，并让冷冻颗粒在冰上解冻。使用 1-ml 自动移液器轻轻重悬沉淀，直至所有聚集体溶解。
*在程序 B 中，我们发现可以从 4 L 的对数后期寄生虫培养物中纯化约 700 mg 线粒体。为了纯化线粒体核糖体，需要 3 g 干重线粒体。因此，在mitoribosome纯化之前，必须重复程序 B 几次以获得足够量的线粒体。
2. 将重新悬浮的线粒体溶液汇集到一个 50 mL Falcon 管中。添加 27 mlL裂解缓冲液。
3. 将重新悬浮的线粒体溶液转移到足够数量的 15 mL 玻璃 Dounce 陶工上。使用杵 A 裂解线粒体（它提供的破坏细胞器的阻力较小）。至少需要 10 次冲程。
4. 在 4°C 下孵育 15 分钟。
5. 转移到 JA-25.50 管中并在 25,000 × g和 4°C 下离心 20 分钟以澄清裂解物。保留上清液（约 27 mL）。
6. 在 50.2Ti 管中的三个 40% 蔗糖垫的顶部轻轻加载线粒体裂解液（上一步的上清液）。每管应含有 3ml 蔗糖溶液和 9ml 线粒体裂解物，对应于 ~4 × 10 10 –8 × 10 10细胞当量。为了便于观察颗粒，应确定靠近转子外部的试管一侧。
7. 在具有 50.2Ti 转子的超速离心机中，在 4°C 下以 244,000 × g将装有样品的蔗糖垫离心 3 小时。
8. 小心去除上清液。从 10 mL 血清移液器开始，以 200 μL 移液器和合适的吸头结束，直到完全清除上清液。去除上清液后，含有高分子量线粒体复合物的颗粒应清晰可见。
9. 洗涤颗粒以消除蔗糖。为此，添加 50 μL 的单体缓冲液，让液体轻轻覆盖颗粒而不重新悬浮，然后通过移液去除缓冲液。
10. 使用 200 μL 自动移液器*添加 200 μL单体缓冲液，以恢复颗粒。
*这一步很微妙，不应该直接取颗粒，而是轻轻地将液体上下移到颗粒上，不要产生任何气泡。
11. 将重新悬浮的颗粒汇集到 1.5 mL Eppendorf 管中；用 50 μL单体缓冲液清洗每个 50.2Ti 管，然后加入 Eppendorf 管中。再次使用 200 µL 自动移液器，通过轻轻上下移液继续重悬。让 Eppendorf 管在 4°C 的旋转轮上以中速放置 60 分钟，以完成复合物的再悬浮，直到连续的蔗糖梯度准备就绪（参见食谱）。
12. 这些颗粒含有高分子量线粒体复合物：核糖体、解离的核糖体亚基，还有呼吸复合物等。
13. 使用NanoDrop TM设备量化线粒体复合物*。
*核糖体是一种核糖核蛋白复合物，其 RNA 在 260 nm 处吸收，其蛋白质在 280 nm 处吸收。因此，通过使用 BSA 等效测量，可以看到 2 个峰，这证实了样品中含有一些核糖体。可以预期的总蛋白质量约为 2 毫克。
14. BioComp梯度主控器 108在 TH-641 管中制备连续的 10 – 30% 蔗糖梯度（长梯度、短帽）。
15. ）轻轻分层到两个10-30% 蔗糖梯度上。
16. 在摆动斗式转子 TH641 上以 86,600 × g和 4°C离心梯度 14 小时 30分钟。
17. 使用BioComp活塞梯度分馏器装置对梯度进行分馏；应收集 350µl 的 30 份。监测 260 nm 和 280 nm 的吸光度以选择含有核糖体的分数。通常会观察到 3 个主要峰，分别对应（从轻到重）大亚基、小亚基和单体（图 2）。为了确认这些峰含有线粒体复合物，进行了质谱分析。如果准备了几个梯度，我们将所有对应于相同峰的分数汇集起来。值得一提的是，与其他已知的核糖体结构相比，动质体中的小核糖体亚基大得惊人，甚至比“大核糖体亚基”还要大，这解释了为什么在蔗糖梯度中发现它的分子量略高。

图 2. 线粒体复合物分离后的蔗糖梯度曲线。
10 – 30% 蔗糖梯度上的线粒体核糖体复合物分布，显示 3 个峰。最轻的部分包含大亚基 (LSU) (1)，最重的部分包含单体 (3)，它们之间是小亚基 (SSU) (2)。

18. 在固定角转子 TLA110.3 上以 490,000 × g和 4°C 离心 2 小时 30 分钟，使核糖体沉淀。标记管以记住它们的方向。
19. 弃去上清液；在试管底部应该可以看到透明的淡黄色颗粒。对于 Cryo-EM 分析，确保去除全部上清液，因为蔗糖会影响显微照片的质量（此步骤对于蛋白质组学或 RNA 分析不太重要）。
20. 将核糖体颗粒重新悬浮在 30 μL 的单体缓冲液中，然后转移到冰上的 1.5 mL Eppendorf 管中。颗粒应易于重新悬浮。同样，避免气泡和尽量减少空气/水界面至关重要。
21. 使用NanoDrop TM设备量化核糖体。冷冻电镜的理想浓度是 1 – 2 µg/µL 蛋白质（使用 BSA 等效测量）。理想的 260/280 比率约为 1.9，在 260 nm 处有一个强峰，在 280 nm 处有一个峰高的一半。
22. 在这个阶段，应直接准备低温电磁网格。还可以将所需浓度的核糖体等分并在液氮中快速冷冻以进行进一步分析（蛋白质组学、RNA 分析等）。您可以使用之前在氮气中快速冷冻的解冻核糖体制备低温 EM 网格，但这会影响复合物的质量。

D. 低温网格的制备
1. 在这个阶段， Quantifoil R2/2 300 目多孔碳网格，涂有薄的自制连续碳（由于使用Safematic CCU-010 碳涂层机蒸发了 2nm 的薄碳层）。事实上，使用这种设备，碳在云母片上蒸发，然后以 30° 角插入一个装满软化水的小盒子中。蒸发层将与云母片分离并漂浮在水面上。 Quantifoil网格安装在表面下方，然后通过从盒子中排水来降低表面，碳层将落在无塑料Quantifoil R2/2 网格的顶部。
2. 3 mA的辉光放电装置对网格进行辉光放电20 秒。
3. 使用Vitrobot Mark IV 设备准备低温网格。腔室参数为：温度 4°C 和湿度 100%。
4. 1 至 2 µg/µL 浓度下使用 4 µL 核糖体溶液。将样品在网格上孵育 30 秒，然后在吸墨力 5 下用滤纸自动吸墨 2 秒，在液体乙烷中快速冷冻。每个样品至少应一式两份制备。
5. 将网格存储在液氮中，直到数据采集。

食谱

细胞培养
1. 点燃介质
3克肝输液肉汤
5克细菌胰蛋白酶
4克氯化钠
8 克 Na 2 HPO 4
0.4 克氯化钾
1克葡萄糖
用 HCl 将 pH 值调节至 7.2
用蒸馏过的 H 2 O调节至 1 L
使用前加入 10ml 1.25 mg/mL 的 Hemin 溶液、100 ml 灭活胎牛血清和 10 mL 青霉素/链霉素 10,000 U/ mL。
2. 1.25 mg/mL 血红素溶液
将 125 mg 的 Hemin 添加到 100 mL 的 20 mM NaOH 中，通过高压灭菌消毒，并用 0.2 μM过滤器过滤以去除聚集体。
3. BHI培养基
将 37 g BHI 粉末添加到 1 L 蒸馏 H 2 O 中，并用 NaOH 将 pH 值调节为 7.4。通过高压灭菌消毒。
使用前，将 10 mL 的 Hemin 溶液以 1.25 mg/mL、100 mL 灭活胎牛血清和 5 mL 青霉素/链霉素 10,000 U/ mL 混合。

线粒体纯化
1. 磷酸盐缓冲液 pH 7.9 0.2 M
将 93 mL 的Na 2 HPO 4 · 7H 2 O 0.2 M 与 7 mL 的 NaH 2 PO 4 0.2 M混合。
加入蒸馏水直至体积为 200 mL。
2. 洗涤缓冲液
20 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7.9
20 毫米葡萄糖
150 毫米氯化钠
3. SoTE缓冲液
600 毫米山梨糖醇
20 mM Tris-HCl pH 7.5
1 毫米乙二胺四乙酸
4. SoTE -EDTA 缓冲液
600 毫米山梨糖醇
20 mM Tris-HCl pH 7.5
20 毫米乙二胺四乙酸
5. SoTM缓冲液
600 毫米山梨糖醇
20 mM Tris-HCl pH 8.0
5 毫米氯化镁2
6. 不连续 L. Tarentolae的Histodenz TM梯度
SoTE缓冲液制备 50% (w/v) Histodenz TM溶液。然后稀释至10 mL 21.7%； 25%； 28.3%； 31.6% Histodenz TM 带SoTE缓冲液。在 38 毫升超透明管上加载 8 毫升的每种溶液。
7. 不连续用于T. Cruzi的Histodenz TM梯度
SoTE缓冲液制备 50% (w/v) Histodenz TM溶液。然后稀释至有28%的10毫升； 25%； 21%； 18% Histodenz TM 带SoTE缓冲液。在 38 mL 超透明管上加载 8 mL 的每种溶液。

核糖体纯化
1. HEPES-KOH pH 7.6 1M
在合适的容器中制备 150 mL 的蒸馏H 2 O。
添加47.7克HEPES
使用 KOH 将溶液调节至最终所需的 pH 值。
添加蒸馏H 2 O以达到 200 mL 的最终体积。
2. 线粒体裂解缓冲液
20 mM HEPES-KOH Ph 7.6
100 毫米氯化钾
20 毫米氯化镁2
1 毫米 DTT
1% 海卫 X-100
2% W/V DDM
完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物
3. 单体缓冲液
20 mM HEPES-KOH pH 7.6
100 毫米氯化钾
20 毫米氯化镁2
1 毫米 DTT
0.02% W/V DDM
完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物
4. 40% 蔗糖坐垫
40% (w/v) 蔗糖
20 mM HEPES-KOH pH 7.6
100 毫米氯化钾
20 毫米氯化镁2
1 毫米 DTT
0.02% W/V DDM
完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物
5. 10 – 30% 蔗糖梯度

准备 10% 蔗糖溶液
10% (w/v) 蔗糖
20 mM HEPES-KOH pH 7.6
100 毫米氯化钾
20 毫米氯化镁2
1 毫米 DTT
0.02% W/V DDM
完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物

准备 30% 蔗糖溶液
30% (w/v) 蔗糖
20 mM HEPES-KOH pH 7.6
100 毫米氯化钾
20 毫米氯化镁2
1 毫米 DTT
0.02% W/V DDM
完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物
使用Biocomp梯度主 108 进行混合。

致谢

这项工作得到了法国国家项目投资框架下LabEx财团MitoCross的“法国国家医学研究所”、“国家科学研究中心”、波尔多大学的支持。 d'Avenir （ANR-11-LABX-0057_MITOCROSS，发给 MS）和欧洲研究委员会启动资助（ TransTryp ID 759120，发给 YH）。该协议改编自Soufari 等。（2020 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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