材料和试剂

1.移液器尖端微型 40 μ m 细胞过滤器（Bel-Art Flomi，目录号： 136800040）
2.标准 10 cm 培养皿（每个样品一个）
3.标准 20 mm 组织培养皿（每个样品一个）
4.标准1.5 mL 微量离心管
5.标准 1 mL 移液器吸头（ThermoFisher ART 2079 或类似产品）
6.宽孔 1 mL 移液器吸头（ThermoFisher ART 2079GPK 或类似产品）
7.DMEM，无染料（ThermoFisher，Gibco，目录号：21063029）
8.胎牛血清（ThermoFisher，Gibco，目录号：26140079或类似）
9.0.25% 胰蛋白酶 EDTA（ThermoFisher，Gibco，目录号： 25200056）
10.10μm岩石抑制剂Y-27632（ATCC，目录号：ACS-3030 ）
11.DNase 1（Roche，目录号：04716728001）
12.胶原酶A（Roche，目录号：10103578001）
13.HBSS（ThermoFisher，Gibco，目录号： 14175095）
14.牛血清蛋白（Sigma-Aldrich，目录号： 03117332001）
15.与您的自动细胞计数器兼容的吖啶橙/碘化丙啶活/死染色试剂盒（即Nexcelom CS2-0106）
16.如果您的自动细胞计数器需要兼容的一次性玻片（即Nexcelom CHT4-PD100）
17.消化混合物（见食谱）
18.重悬溶液（见配方）
19.25 mg/mL 胶原酶 A 原液（参见配方）
20.10 mM Y27632 原液（参见配方）
注意：所有试剂均按照制造商的建议储存并在标记的有效期之前使用。

设备

1.摇动热块（例如，Eppendorf Thermomixer 5384000020）
2.解剖显微镜（对于这种方法，我们更喜欢具有 6.3 × – 40 ×可变变焦光学元件的显微镜）
3.冷冻微量离心机 350 × g （例如，Eppendorf 5425R）
4.自动细胞计数器（Nexcelom Cellometer Auto2000 或类似的兼容荧光活/死染色试剂盒）
5.Vannas剪刀，弯曲的（Fine Science Tools，目录号：15019-10或类似）
6.Fine Bonn Scissors，直或直刃 Vannas 剪刀（Fine Science Tools，目录号：14084-08 或类似）。
7.细镊子（Dumont #1、#5 或类似产品）

程序

图 1. 分离角膜缘/虹膜角膜角/边缘区域。
（A - D）在一个 10 厘米的盘子中工作，其中包含冰冷的 HBSS，新鲜收获的眼睛被清除结缔组织，一分为二，晶状体、视网膜、虹膜和睫状体被移除。 (E) 使用弯曲的 Vannas 剪刀，在角膜缘前立即去除角膜。 (F) 然后在睫状体后方进行第二次切割，以隔离角膜缘/虹膜角膜角/角膜缘区域。 (G - H) 分离的角膜缘/虹膜角膜角/边缘区域样品立即转移到冰冷的无染料 DMEM 中，并用细剪刀切碎。 (I) 将切碎的组织转移到微量离心管中进行后续分离。

A.虹膜角膜角区解剖
一旦开始，应尽可能快地进行解剖以限制细胞死亡率。根据我们的经验，完整的解剖过程需要一名经验丰富的外科医生每只眼睛大约 5 分钟，如果同一个人同时执行安乐死/摘除和显微解剖，则需要增加几分钟。
1.根据当地动物护理和使用委员会批准的协议牺牲小鼠。在我们的实验室中，首先通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物对小鼠进行麻醉，然后进行颈椎脱位以实施安乐死。
2.安乐死后，立即用剪刀剪开眼窝的外侧，切开结膜和周围组织，从而摘除眼球。在这个阶段注意不要刺破眼睛。做这个切口后，通过拉回眼窝周围的组织并用镊子牢牢抓住视神经来摘除眼睛。然后可以将眼睛干净地拉开并置于冰冷的 HBSS 中。
3.要解剖虹膜角膜角/角膜缘区域，首先使用直剪刀从地球上干净地修剪尽可能多的结膜和结缔组织（图 1A）。注意不要刺破地球本身，因为眼睛的通缩会使这个过程更加困难。接下来，在矢状或横向方向将地球切成两半，使边缘和睫状体将每个部分一分为二（图 1B - 1C）。取下镜头并丢弃。使用镊子取出视网膜，然后使用弯曲的 Vannas 剪刀小心地修剪虹膜和睫状体（图 1D）。注意不要损坏角度区域，并在留下一些睫状体或虹膜组织的一侧犯错。接下来，在抓住视神经留下的孔附近的巩膜时，使用弯曲的剪刀去除角膜，在不损坏角度区域的情况下尽可能靠近角膜缘切割（图 1D - 1E）。取出角膜，然后在睫状体根部正下方进行第二次平滑切割，以释放角膜缘/虹膜角膜角区域（图 1E - 1F）。在白化病小鼠中工作，这块组织看起来类似于柔软的指甲剪。立即将此组织转移到含有 10% FBS 的冰冷 DMEM 的 20 mm 细胞培养皿中，并继续将角膜缘区域与眼睛的另一半和对面的地球隔离开来。解剖后，您将获得每只小鼠的 4 片角膜缘/虹膜角膜角组织。
4.然后在消化前将组织切碎。将工作浸入冰冷的 DMEM + 10% FBS 的小盘中，以防止小组织碎片粘在移液管尖端上，从一端抓住每一片组织，用细剪刀从另一端工作，将组织减少到通过垂直于组织长度的一系列切口进行精细切片（图 1G - 1I）。重复直到所有组织都被切碎到冰冷的培养基中，并立即进行组织消化。

B.组织解离
1.使用配备宽孔尖端的 1 mL 移液器，收集切碎的组织并将其转移到 2 mL 微离心管中以进行组织分离（图 2）。如有必要，让组织沉降（ 1-3分钟），或以 350 × g离心30 秒并去除上清液，为额外的体积腾出空间，直到收集到所有组织。

图 2 。流程图显示了解离过程的概述。

2.让样品在冰上沉淀或以 350 × g离心30 秒，然后小心吸出培养基，而不会干扰组织。
3.μM 的 Y27362的1 mL 预热消化混合物（参见食谱）。轻轻旋转以混合，然后放置在预热的37 ° C热块上，以 450 rpm 的速度摇动。
4.将组织孵育 2 小时。每隔 30 分钟，将试管倒置 3-4 次，轻轻混匀，以确保组织保持悬浮状态。
5.孵育 2 小时后，在 20°C 下以 350*G 离心 5 分钟收集组织碎片和分离的细胞。吸出上清液并在 1 mL 的 DPBS 中轻轻重新悬浮以洗涤。
6.重复离心步骤，然后将组织重悬于 1mL 预热的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 中，其中含有 100 单位的 RNAse free DNase 1。
7.将样品放回 37°C 块中振荡 10 分钟。
8.10 分钟后，使用配备宽孔尖端的 1 mL 移液器研磨样品。通过缓慢吸出 1 mL 并将其返回管中，轻轻地重新悬浮组织。进行 10 次冲程，注意不要通过剧烈混合引入气泡或损坏细胞。
9.回到 37°C 再加热 10 分钟，然后使用普通口径的 P1000 吸头进行 10 次额外的混合冲程。再孵育 5 分钟，然后使用标准孔尖端使用 10 次额外冲程混合。在最后一次冲程中，将细胞悬浮液从 2 mL 转移到 1.5 mL 微量离心管中。
10.在 20°C 下以 350 × g离心 5 分钟收集分离的细胞。在 1 mL 的 DMEM + 10% FBS 中轻轻吸出上清液并重新悬浮细胞颗粒，以中和胰蛋白酶 EDTA。
11.使用配备标准孔 P1000 吸头的 1 mL 吸管轻轻吸出全部样品，将 Flowmi 微型 40 μm 过滤器放在吸管吸头的孔径上，然后将细胞缓慢过滤到新的 1.5 mL 微量离心管中以去除碎屑。注意不要在过滤过程中使细胞承受高压而损坏细胞。
12.重复离心步骤并重新悬浮在含有 1% BSA 的 1 mL HBSS 中。
13.重复离心步骤并吸出上清液。在含有 1% BSA 的 200 μL（见注释）中轻轻重悬细胞。
14.通过额外的 40 μm Flowmi 过滤器过滤细胞，转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。
15.将细胞置于冰上并立即用于下游应用。

数据分析

在为单细胞 RNA 测序或其他应用准备文库之前，使用配备活/死细胞检测功能的自动细胞计数器评估细胞浓度和活力（见注）。通常，我们从六只眼睛的解离中获得 75,000 – 100,000 个细胞，从八只眼睛的解离中获得150 – 200,000 个细胞，存活率在 80 – 95% 之间。较小的样品可以使用类似的方案制备，但会导致细胞数不成比例地减少，因为过滤和样品处理导致的每个样品损失看起来相似，而与最终细胞数无关。最终样品浓度应根据下游应用和靶细胞群的丰度进行优化。
在一项典型实验中，在两次独立的准备中对来自 12 只野生型小鼠眼睛的 19,232 个细胞进行测序后，使用 Seurat 对细胞进行聚类，并估计细胞类型的分布（图 3 ）。虽然获得的大多数细胞映射到葡萄膜、巩膜、角膜组织和黑素细胞，但施累姆管内皮细胞占样本中总细胞的比例不到 1% (109/19232)，而小梁网细胞几乎占 4%。 701/19232)。组织中这些细胞类型的极端稀有性是实验设计和优化过程中的一个关键考虑因素。

图 3. 在 10x 基因组学平台上单细胞 RNA 测序后获得的细胞类型分布。
在两次独立准备中对来自 12 只野生型小鼠眼睛的 19,232 个细胞进行测序后，使用 Seurat 对细胞进行聚类，并估计细胞类型的分布。 SC：施累姆管内皮细胞，Conj：结膜上皮细胞，RPE：视网膜色素上皮细胞，B/T：B 和 T 细胞，vSMC：血管平滑肌细胞，BEC：血管内皮细胞，TM：小梁网，SMC：平滑肌肌肉细胞。

笔记

小鼠品系选择：我们发现色素眼睛的解离导致色素物质的聚集，这些物质难以通过洗涤和过滤去除，并使得后续的活力测试或单细胞 RNA 测序文库的制备变得困难。使用白化病小鼠的眼睛可以消除这个问题，但会限制模型选择，并且需要进行广泛的回交，以便与色素背景上存在的遗传模型一起使用。当使用有色眼睛时，可能需要额外的流式细胞术或过滤步骤以在用于下游应用之前从样品中去除色素聚集体。

解剖：我们通常使用两个人执行该协议的这个阶段，这样一个人就可以负责小鼠的人道安乐死和球体的摘除，而他们的同事在解剖显微镜下对虹膜角膜角区域进行解剖。一个调查员可以同时处理这两项任务，但在这种情况下，我们通常会在开始精细解剖之前将所有眼睛收集在冰冷的 HBSS 中。

组织消化：每个样品需要 1 mL 的预热 DMEM + 10% FBS，在开始解剖之前，我们在 1.5 mL 微量离心管中准备 1 mL 等分试样。这些可以放在 37°C 块上以在开始协议之前预热。

最终悬浮体积：对于使用六只成人眼睛的准备，我们通常以 200 μL 的体积进行最终再悬浮。过滤后，最终样品体积约为 150 μL，细胞浓度约为每 μL 650 个细胞。对于使用较少眼睛的制备，应根据需要使用较小的体积来优化下游应用的样品浓度。

细胞计数和活死染色：在我们的实验室中，使用Nexcelom Cellometer Auto2000 自动细胞计数器和兼容的 Nexcelom 品牌吖啶橙/碘化丙啶活/死染色试剂进行细胞计数和活死染色。

食谱

1.消化混合物
在开始协议的消化步骤之前立即为每个样品制作 1 mL。
通常，我们将 1 mL 的 DMEM 等分试样预热至 37°C，并在使用前立即添加其他试剂（即<5 分钟）。
试剂最终浓度数量
含有 10% FBS 的 DMEM-1毫升
胶原酶 A，25 mg/mL 原液1毫克/毫升40微升
Y27362，10 毫米库存10微米_1微升
不适用

2.再悬浮液
使用前过滤除菌，4°C保存
试剂最终浓度数量
HBSS10 毫升
牛血清白蛋白1% W/V0.1克
全部的10 毫升

3.25 mg/mL 胶原酶 A 储备液
以 50 μ L 的等分试样在 -20 °C 下储存
试剂最终浓度数量
胶原酶 A（冻干）25毫克/毫升100 毫克
ddH 2 O不适用4 毫升
全部的不适用4 毫升

4.10 mM Y27632 原液
以 50 μ L 的等分试样在 -20 °C 下储存。解冻后，等分试样可在 4 °C下保存两周。
试剂最终浓度数量
Y2763210毫米10毫克
ddH 2 O不适用3 毫升
全部的不适用3 毫升

致谢

我们感谢 Drs。 Robert Lavker 和 Nihal Kaplan（西北大学 Feinberg 医学院）进行了有益的讨论并分享了他们的细胞解离方案（在Kaplan等人，2019 年描述），该方案是基于该方案的。自动细胞计数和质量控制由 Feinberg 医学院遗传医学中心的 Jennifer Chin Man Wai 博士进行。此处描述的工作由 R01 EY025799（至 SEQ.）、R01 EY032609（至 BRT）和 Brightfocus 基金会在黄斑变性研究中对 BRT 的新研究人员资助。

利益争夺

Benjamin Thomson 从拜耳获得研究经费。 Susan Quaggin 拥有 Mannin Research Inc. 的股票，并从 AstraZeneca、Janssen、Lowy Medical Research Foundation、Novartis、Pfizer、Janssen 和 Roche/Genentech 获得咨询费。

伦理

动物实验经西北大学动物护理和使用委员会（美国伊利诺伊州埃文斯顿，动物协议号 IS000150015，有效期 2020/4/30-2023/4/29）批准，并符合 ARVO 脊椎动物护理和使用指南眼科研究的研究对象。

参考

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2.Kaplan, N.、Wang, J.、Wray, B.、Patel, P.、Yang, W.、Peng, H. 和 Lavker, RM (2019)。单细胞 RNA 转录组有助于定义角膜缘/角膜上皮干细胞/早期转运扩增细胞以及自噬如何影响这一群体。 Invest Ophthalmol Vis Sci 60（10）：3570-3583。
3.Patel, G., Fury, W., Yang, H., Gomez-Caraballo, M., Bai, Y., Yang, T., Adler, C., Wei, Y., Ni, M., Schmitt, H .，等人。（2020 年）。由单细胞转录组学定义的人眼流出组织的分子分类。 Proc Natl Acad Sci USA 117(23): 12856-12867。
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5.Tektas, OY 和 Lutjen-Drecoll, E. (2009)。不同类型青光眼小梁网的结构变化。 Exp Eye Res 88（4）：769-775。
6.Thomson, B.、Liu, P.、Onay, T.、Du, J.、Tompson, S.、Misener, S.、Purohit, R.、Young, T.、Jin, J. 和 Quaggin, S.（ 2021）。细胞串扰调节房水流出途径并为青光眼治疗提供新靶点。国家通讯12（1）：6072 。
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