设备

VS120 载玻片扫描仪 (Olympus) 或任何其他能够扫描和数字化整个载玻片的显微镜
计算机：64 位 Windows、Linux 或 Mac，至少 16 GB RAM 和快速多核处理器（例如，Intel Core i7）
注意：此协议可能适用于功能较弱的计算机或 RAM 较低的情况，但分析速度会很慢，并且可能会遇到内存错误。有关详细信息，请参阅QuPath在线文档 ( https://qupath.readthedocs.io/ )。

软件

QuPath 0.3.2 开源软件（ https://qupath.github.io/ ）
自定义QuPath脚本位于： https ://github.com/jo-maree/BioProtocol-2022-Scripts
记事本或任何其他简单的文本编辑器，用于更改脚本和分类器
Microsoft Excel 或类似软件
GraphPad Prism（GraphPad Software https://www.graphpad.com/ ）或类似的

程序

染色和扫描组织切片
染色和扫描切片的具体协议将取决于起始材料、个别实验室实践和幻灯片扫描设备，因此此处不再赘述。有关我们的组织处理和成像的详细信息，请参阅Courtney等人。（2021 年）。组织应该用透明的核染色剂[例如，DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)] 染色，用于识别细胞核。细胞应该用适当的荧光团清楚地标记。在我们的案例中，荧光标签是基因编码的，但经过优化的免疫组织化学染色应该会产生可比较的结果。
QuPath使用BioFormats (Linkert et al. , 2010)处理从大多数幻灯片扫描平台导入文件。 BioFormats目前支持 150 多种不同的文件格式，包括 .与, . svs ,. czi和 .tiff。应以足够高的分辨率扫描图像，以清晰地识别细胞核和其他细胞结构——我们使用 VS120 载玻片扫描仪的 40 ×物镜提供分辨率为 160.3nm/像素的图像；然而，在染色清晰的情况下，这种分析应该可以在较低的分辨率下进行（例如，20 ×物镜的 322nm/像素）。导入QuPath的图像应该包含一个平面（我们的图像是在一个平面上拍摄的，但是这个协议也适用于 z-stack 图像的投影），并且每个大脑部分应该保存为一个单独的文件而不是一个包含多个部分的整个幻灯片。
注意： QuPath可以导入 z-stack 图像和具有多个部分的单个图像，因此在这种情况下可以进行这种分析；但是，为此分析编写的自定义脚本需要适应这些场景，并且描述如何这样做超出了本协议的范围。

创建项目并准备图像
QuPath中进行任何分析的第一步是创建一个项目。这允许保存可跨多个图像使用的脚本和分类器。请注意，该项目永远不会包含实际的图像文件，只包含与它们相关的数据和原始图像的链接。项目文件夹不必与图像存储在同一位置，但如果将它们分开（例如，服务器上的图像和外部硬盘驱动器上的项目），以后可能很难恢复链接时间;因此，建议至少将它们放在同一个驱动器上。
创建项目并添加图像
在您的文件管理系统中，创建一个新文件夹（目录）并为其命名。该文件夹将存放QuPath项目文件和所有相关数据。
启动QuPath并选择“创建项目”。
导航到您刚刚创建的文件夹，双击打开它，然后单击选择文件夹。
选择“添加图像”以打开“导入图像”对话框（图 1A）并选择如下选项：
拖放到框中或选择以下四个按钮之一来选择要分析的文件（例如，从文件管理器中选择要选择的文件）。
图像提供者：保留为默认值（让QuPath决定）。
设置图像类型：荧光。
旋转图像：根据扫描图像的方向，您可能希望将它们旋转 90 °、180° 或 270°，或者不旋转。
可选参数：将此留空。
自动生成金字塔：选中。
导入对象：未选中。
单击导入按钮将图像链接到您的QuPath项目。
打开文件管理器，在步骤 B1b 中创建的文件夹中，现在应该有两个文件夹，“分类器”和“数据”。添加名为“脚本”和“导出”的新文件夹以放在它们旁边。您的文件夹现在应该如图 1B 所示。
将与此协议关联的所有脚本 (.groovy) 文件复制到脚本文件夹中 (图 1C)。

图 1. 图像导入和示例文件夹结构。
A) 导入图像对话框，显示需要旋转 180 度的四张荧光图像的导入。 B) 建立QuPath项目文件夹结构。 C) 脚本文件夹中的 Groovy 脚本文件。

设置通道颜色、名称和类
QuPath 会自动按红色、绿色、蓝色、黄色、青色和洋红色的顺序为通道着色，但是，根据文件格式和扫描选项，这可能对您的图像不正确。这可以使用以下脚本一次纠正所有图像。
QuPath中的 Channels and Colors 脚本，并在脚本编辑器中打开它（图 2A）。
我们的图像通道按照蓝色 > 绿色 > 红色的顺序进行扫描，因此脚本以这种方式排序。要检查您自己的设置，请打开QuPath中的亮度和对比度面板以查看当前顺序（图 2B）——您需要打开一个图像来执行此操作。如果需要，调整getColorRGB行的顺序（图 2A）。使用 RGB 值设置颜色（即., 255, 0, 0, = 纯红色）。
通道名称的设置顺序与颜色相同——根据您的项目更改名称或顺序。
注意：这些频道名称在其他脚本中被引用，所以如果您在这里使用不同的名称，您必须记住在其他地方更改它们。
在“运行”菜单中，选择“为项目运行”以将此脚本应用于所有图像。颜色和通道名称将发生变化，并将反映在图像中（图 2C）。
注意：如果您在运行脚本时打开了图像，则需要文件 > 重新加载数据（选择确定）以查看打开图像中的更改。
在类列表下方，打开更多选项列表 ( ⋮ ) 并选择“从图像通道填充”。当询问是否保留现有的可用课程时，选择“否”。类列表现在应该反映通道名称。
再次打开 More Options 列表并创建两个名为“Tissue”和“Vessels”的新类。

图 2. QuPath 脚本编辑器和更改颜色和通道。
A) QuPath 的脚本编辑器打开了通道和颜色脚本。 B) 导入图像时的亮度和对比度面板显示颜色与 VS120 幻灯片扫描仪提供的通道名称不匹配。 C) 运行通道和颜色脚本后的亮度和对比度面板显示适当的颜色和通道名称。

确定最佳参数
重复项目
关闭项目（文件 > 项目... > 关闭项目）。
在文件管理器中，导航到包含项目的文件夹并复制整个文件夹。现在您有一个用于优化的项目和一个用于分析的项目。适当地重命名文件夹。
在QuPath中，打开优化项目。
为手动计数创建小注释
确定自动细胞检测的最佳参数始于手动计数 DAPI 染色的细胞核DsRed 标记的周细胞和 GFP在小注释中标记的小胶质细胞。这些计数与来自一系列自动检测参数的计数进行比较——在这种情况下，是不同的强度阈值。为了确保选择的阈值适合每个单独的区域，我们在每个感兴趣的大脑区域放置了测试注释，并独立分析了这些区域（图 3）。在具有显着异质性的大脑区域（例如，皮质和海马）中，放置了两个测试区域以反映该区域的不同特征。测试区域的大小设置为每个包含约 100 个核。如果您的项目包含大量图像，您可以选择仅使用图像子集进行优化，在这种情况下，其他图像可能会从优化项目中删除。
打开第一张图片。
对象 > 注释... > 指定注释。
选中“使用 µm”，然后指定 300 µm 宽、200 µm 高和名称 = “上皮层”的注释（图3A）。单击添加注释。
注意：这些是我们使用的小注解的规格和名称，但这些可以更改为与您的项目相关的大小和名称。
指定注释框将保持打开状态，因此继续添加另外五个注释，名称为“下皮层”、“DG”、“CA1/CA3”、“丘脑”和“下丘脑”（图 3B、C）。
关闭指定注释框。如果需要，请检查视图 > 显示名称。
将每个注释移动到图像上的适当位置。尽量避免将注释定位在组织中的孔或大血管上。移动注释时要小心，不要意外调整它们的大小-确保单击中心进行移动，而不是靠近边缘。
在文件菜单中，选择对象数据... > 导出为GeoJSON 。选择所有对象并选择默认选项（图 3D）。这会将注释记录以 . geojson文件。
对于剩余的每个图像，拖放 . geojson文件到图像中以复制注释，然后根据需要调整它们的位置。

图 3. 放置和导出注释以进行优化。
A) 指定注释对话框，要求指定第一个计数注释。 B) 大脑部分的左半球，显示六个计数注释的位置。 C) B 中白框包围的区域的详细信息。 D) 对象导出设置。

手动计数细胞
在开始手动计数细胞的过程之前，值得花时间检查图像并确定如何决定应计数哪些细胞核和哪些细胞并将其标记为阳性。在开始之前制定决策的具体标准将确保您的计数是一致的。
打开第一张图片。
调整缩放和通道视图以清楚地看到细胞核——通常，最好关闭除 DAPI 之外的所有通道并设置为灰度以获得清晰。
导航到第一个 300 µm × 200 µm 框。
选择点注释工具 - 计数窗口将打开（图 4A）。
单击添加三次以创建三个新点注释。依次双击它们，将它们重命名为 DAPI、GFP 和DsRed ，并将它们的颜色分别更改为蓝色、绿色和红色。
每个核的中心放置点（图 4B）。
当您识别出所有细胞核后，更改通道视图，以便您可以看到表达 GFP 的小胶质细胞。
选择 GFP 注释并检查每个带注释的核。如果它对 GFP 表达呈阳性，则在蓝色的旁边添加一个绿色点，或与蓝色点重叠（图 4C）。
注意：如果没有标记细胞核，请勿将细胞标记为 GFP 阳性。这可以防止意外计数实际上不是细胞的荧光点，并确保采样始终限于细胞核位于焦平面中的那些细胞。您可能会发现保持计数和亮度和对比度窗口都打开并根据需要调整视图和点会很有帮助；但是，请确保对亮度和对比度的任何调整都不会影响结果。
重复DsRed注释以标记DsRed阳性周细胞。
在 Hierarchy 选项卡可见的情况下，选择 Object > Annotations...> Resolve Hierarchy。这应该将三点注释插入到父矩形注释中。
对每个小矩形计数矩形重复步骤 C3e - C3j。
注意：您最终会在计数窗口中看到称为 DAPI、GFP 和DsRed的多个注释—使用层次结构选项卡并确保在完成每组后插入层次结构可以更轻松地跟踪。您可以在 Hierarchy 选项卡中选择特定的注释，它们将在 Counting Window 中被选中。
对所有其他图像重复此过程。

图 4. 手动计数注释和细胞检测示例。
A) 计数窗口。 B) DAPI 染色的细胞核以灰度显示并标有蓝点注释。 C) GFP（箭头）和DsRed （箭头）阳性细胞分别标有绿色和红色点注释。 D) 自动细胞检测和分类后的相同细胞。

导出手动计数数据
确保保存所有图像，然后选择测量 > 导出测量。
将所有图像添加到所选列。单击选择并选择优化项目结构中的导出文件夹并输入适当的文件名（例如，手动计数）。对于导出类型，选择注释，对于分隔符，选择选项卡 ( tsv )。
单击填充以填充要包含的列列表。从此列表中选择：图像、名称、父级、点数。
单击导出。
使用 Excel 打开文件。
将手动计数数据排列到三个表中——每个通道一个（DAPI、GFP、 DsRed ） ——如图 5 所示。
注意：图 5 中显示的布局和颜色不是必需的，但有助于步骤 C6d 中描述的查找过程。

图 5. 来自多个大脑区域内的小注释的 DAPI 阳性细胞核手动计数表。

细胞检测的测试参数
注意： QuPath 的细胞检测算法提供了许多不同的参数，可以更改这些参数以优化细胞检测。我们发现要优化的最重要参数是强度阈值，对于我们的组织，将其他参数保留在默认水平会产生良好的结果。因此，该协议及其相关脚本仅优化阈值参数。您可能会发现需要进一步优化其他参数，包括背景半径（用于减去背景染色的滚动球的大小；如果存在高水平的背景染色，优化可能很有用）和 sigma（测量应用的平滑水平；如果核染色不均匀，可能需要提高；如果核通常非常靠近，则可能需要降低）。如果是这种情况，那么与 Courtney 等人相关的脚本。 (2021) 提供了优化 sigma 和背景半径以及阈值的能力，并且可以进一步适应其他参数。
在 Automate > Project Scripts 下找到 Cell Detection 脚本的优化。
选择运行 > 运行。
您将看到一系列输入框，以指定您要在 DAPI 通道中测试多少个不同的阈值以进行细胞检测，以及起始（最低）测试值应该是多少以及剩余测试值的增量值（例如，如果要测试阈值 150、200 和 250，则应分别输入“3”、“150”和“50”）。
该过程完成后，您将看到一个弹出通知，并且数据文件将保存在项目文件夹中名为 Optimization Results 的文件夹中。
分析细胞检测参数
为了确定最佳细胞检测参数，需要使用以下公式将自动计数与手动计数进行比较：
% Difference=((AutomatedCount-ManualCount)/ManualCount)*100

使用 Excel 从优化结果文件夹中打开 DAPI Results.csv 文件。
删除除标题为 Image、Annotation、Threshold 和 Cells 之外的所有列。这些现在应该分别是 A、B、C 和 D 列。
将步骤 C4f 中创建的 DAPI 手动计数表复制到数据右侧几列的电子表格中（例如，从单元格 I1 开始）。
将标题手动添加到 E 列的第一个单元格，并使用 DAPI 手动计数表作为参考输入每个图像和注释的相关手动计数数字。
注意：由于行数是图像、区域和阈值（以及 sigma 和半径，如果您已经测试过）的乘积，因此行数可以达到数百或数千。手动输入手动计数既繁琐又容易出错，因此我们建议您使用 Excel 的各种查找功能之一来帮助此过程。有多种方法可以实现这一点，您选择的方法可能取决于您对 Excel 的熟悉程度，但此处详细介绍了一种使用 INDEX-MATCH 的方法：
确保步骤 C6c 中 DAPI 手动计数表中的图像和注释名称与数据表中的名称完全匹配。
选择包含手动计数的单元格（图 5 中的黄色）并在名称框中将此范围命名为“计数”。
选择包含图像名称的单元格（图 5 中的橙色）并在名称框中将此范围命名为“ ImageNames ”。
选择包含区域的单元格（图 5 中的蓝色）并在名称框中将此区域命名为“区域”。
在单元格 E2 中输入公式 =INDEX(Counts, MATCH(A2, ImageNames , 0), MATCH(B2, Regions, 0))
将此公式复制到整列。
创建一个格式为百分比的新列 (F)，并使用公式 =(D2-E2)/E2 计算百分比差异。将此公式复制到整列。
对于每个区域，使用 GraphPad Prism 或类似软件绘制每个阈值处的百分比差异。确定哪个阈值最可靠地给出接近 0 的百分比差异。这将是该区域的最佳 DAPI 阈值（图 6A）。
为了进一步确认所选阈值是否合适，可以计算每个图像中该阈值的手动计数和自动计数之间的相关性（图 6B）。

图 6. 确定最佳 DAPI 阈值的图表示例。
A) 根据测试的荧光阈值绘制一个大脑区域中手动和自动计数之间的平均（标准偏差）百分比差异。平均值最接近 0 的点（箭头）表示最佳阈值。 B) 手动与自动计数的相关图，用于在多个图像中单个大脑区域的最佳阈值。接近 1 的 Pearson 相关系数 (r) 表明选择的阈值是合适的。

细胞分类的测试参数
在 Automate > Project Scripts 下找到 Cell Detection 脚本的优化。
在运行脚本之前，您需要调整两行代码，如下所示：
第 16 行：
def region = ['上皮层'，'下皮层'，'DG'，'CA1/CA3'， '丘脑'，'下丘脑']
调整区域名称以匹配您的注释（注意：这就是为什么正确和一致的拼写和大写至关重要）。
第 17 行：
def DAPIthresholds = [150, 150, 75, 75, 150, 150]
调整 DAPI 阈值以匹配先前确定为每个区域最佳的阈值。确保顺序与第 16 行中的相同。
选择运行 > 运行。
出现提示时，选择优化 GFP 通道并设置阈值所需的数量、开始和增量。
结果将保存在优化结果文件夹中。
对DsRed通道重复步骤 C7c – C7e。
关闭优化项目。
分析细胞分类参数
使用 Excel 从优化结果文件夹中打开 GFP Results.csv 文件。
将步骤 C4f 中创建的 GFP 手动计数表复制到电子表格中。
创建一个新列并为每个图像和区域输入相关的手动计数。此处可以使用步骤 C6d 中描述的相同查找策略。
创建一个格式为百分比的新列并计算百分比差异：
（细胞计数 - 手动计数）/手动计数
对于每个区域，使用 GraphPad Prism 或类似软件绘制每个阈值处的百分比差异。确定哪个阈值最可靠地给出接近 0 的百分比差异。这将是该区域的最佳 GFP 阈值。
DsRed重复步骤 C8a – C8e 。

检测组织并定义感兴趣区域
定义感兴趣区域
QuPath中打开分析项目。打开第一张图片。
选择画笔工具。
注意：画笔工具的直径随图像放大而缩放——此设置和起始直径可以在编辑 > 首选项 > 绘图工具中更改。此工具允许您单击并拖动以“绘制”感兴趣的区域。可以通过单击内部并将边界向外推或 Alt-单击外部并推入边界来进一步定义区域。
使用 Allen Brain Atlas 作为指南，在左右半球上绘制与皮层、海马、丘脑和下丘脑相对应的区域。
注意：这些区域可能与大脑的边缘重叠，组织中的任何孔都将在稍后被移除（图 7A）。
将左右半球对合并到每个区域的单个注释中。
通过右键单击并选择 Set Properties 来命名每个区域（Cortex、Hippocampus、Thalamus和 Hypothalamus —请注意使用准确的拼写和大小写）。
在第一张图像中定义了四个区域后，使用 File > Object data... > Export as GeoJSON保存注释。选择所有对象并选择默认选项。这会将注释记录以 . geojson文件。
对于剩余的每个图像，拖放 . geojson文件复制到图像中以复制注释，然后根据需要使用画笔工具对注释进行微调。
检测组织并去除血管
注意：我们脚本中使用的组织检测参数可能需要针对不同的组织和扫描进行调整。我们建议在运行所有图像之前在单个图像上测试脚本，特别是因为此脚本可能需要一些时间才能运行。
打开脚本 Tissue Detection.groovy （自动化 > 项目脚本 > 组织检测）。
Run for Project 将所有图像移至 Selected 列表。
将感兴趣区域与组织相交
打开脚本相交ROIs.groovy （自动化 > 项目脚本 > 相交 ROI）。
Run for Project 将所有图像移至 Selected 列表。区域现在应该适合组织的边缘并移除大的DsRed阳性血管（图 7B）。
目视检查
目视检查每个图像的组织检测，如果需要，使用画笔工具去除任何带有染色或扫描伪影的区域（例如，组织中的褶皱或失焦区域；参见图 7C - F例）或自动化过程遗漏的大型容器，并会干扰优化的细胞检测/分类。

图 7. 区域注释和组织检测。
A) 使用画笔工具定义后的大脑区域注释。 B) 组织检测和 ROI 交叉后的大脑区域注释。 CF) 下面的面板显示了应该从区域注释中删除的伪影示例，包括：C) DAPI 通道中自动对焦失败的区域； D) 封固剂中有气泡； E) 一个来历不明的明亮荧光斑； F) 一块碎片。

应用最佳参数
创建分类器
由于不同的区域可能需要不同的检测阈值，因此您需要创建一个单独的分类器文件，其中包含每个区域的最佳DsRed和 GFP 阈值。
在 Analysis 项目的分类器目录中，创建一个名为“ object_classifiers ”的新文件夹。
使用记事本（或类似工具）打开文件DsRed -GFP Cortex.json 。
将阈值更改为上述步骤 C8 中确定的值，并保存文件，并将“Cortex”替换为object_classifiers目录中的相关区域名称。
对每个区域重复。
将最优参数插入分析脚本
在QuPath中打开 Analysis 项目，Automate > Project Scripts > Cell Classification
按照上面的步骤 C7b 调整代码的第 16 行和第 17 行。
调整代码的第 18 行以正确引用您在步骤 E1 中创建的分类器。
为项目运行分析
在代码的第 20 行，确保regionNum = 1。
Run for Project 将所有图像移至 Selected 列表。
在自动细胞检测和分类之后，检测到的细胞应如图 4D 所示。
导出所有图像的注释数据：
测量 > 导出测量。
将所有图像移动到选定窗格。
选择一个保存位置（我们建议在项目目录中创建一个“输出”文件夹）和一个具有适当区域名称的文件名。
将导出设置为注释并将分隔符设置为 .csv。
单击填充，然后勾选要包含的所有列并单击导出。
在 Excel 中打开 .csv 文件并删除除您当前选择的注释之外的所有注释的行。
对每个区域重复步骤 E3a – E3d，将regionNum更改为 2，然后更改为 3，等等。
注意：每个区域需要单独分析，每次分析后需要保存和提取该区域的数据，以确保使用适当的细胞检测参数。

数据分析

数据分析的细节将取决于所提出的问题。有关我们分析的详细信息，请参阅Courtney等人。（2021 年）图 5。

致谢

这项工作得到了澳大利亚国家健康和医学研究委员会赠款 APP1137776 和 APP1163384 (BAS) 和塔斯马尼亚大学 (DWH) 的支持。
该协议基于Courtney等人中描述的协议。（2021 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争的财务或非财务利益。

伦理

所有动物程序均经塔斯马尼亚大学动物伦理委员会 (A0018608) 批准，并符合澳大利亚 NHMRC 为科学目的而护理和使用动物的实践守则 - 2013 年（第 8 版）。

参考

Bankhead, P., Loughrey, MB, Fernandez, JA, Dombrowski, Y., McArt, DG, Dunne, PD, McQuaid, S., Gray, RT, Murray, LJ, Coleman, HG等。（2017）。 QuPath：用于数字病理图像分析的开源软件。科学代表7（1）：16878。
Courtney, JM, Morris, GP, Cleary, EM, Howells, DW 和 Sutherland, BA (2021)。一种提高整个小鼠大脑切片中周细胞和小胶质细胞定量的自动化方法。 eNeuro 8(6) ：ENEURO.0177-21.2021。
Linkert, M., Rueden, CT, Allan, C., Burel, JM, Moore, W., Patterson, A., Loranger, B., Moore, J., Neves, C., Macdonald, D.等. （2010）。元数据很重要：访问现实世界中的图像数据。细胞生物学杂志 189（5）：777-782。