材料和试剂

CTD-RNAP2 & Ser5ph-RNAP2 F ab生成和染料偶联
15 mL锥形收集管（Fisher Scientific，目录号：14-959-49D）
500 mL Steritop螺纹瓶顶过滤器，0.22 µm，聚醚砜（PES），无菌，33 mm 接头，（Millipore Sigma，目录号：SCGPS05RE）
Amicon Ultracel-4（10 kDa截止值）离心过滤器单元，4 mL 样品体积（Millipore Sigma，目录号：UFC801024）
Amicon Ultracel-10（10 kDa-截止）0.5离心过滤单元（Fisher Scientific，目录号：UFC501024）
0.6 mL 和 1.7 mL 低保留微量离心管（Thomas Scientific，目录号：分别为 1149J99 和 1149K01）
PD - mini G -25 脱盐柱（VWR，GE Healthcare，目录号：95055-984）
使用 15 mL 锥形管进行过滤的支架/支架（我们使用NucleoBond 随附的支架 Xtra Midi Kit，来自Macherey -Nagel，目录号：740420.50）
Pierce Mouse IgG1 Fab 和 F(ab')2 制备试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：PI44980），储存于 4°C
使用的抗 CTD-RNAP2 和抗 Ser5ph-RNAP2 单克隆抗体由 Hiroshi Kimura 博士友情提供，但现在它们已可商购获得（Cosmo Bio USA，目录号分别为：MABI 0601 和 MABI 0603），储存于 4° C
叠氮化钠（Millipore Sigma，目录号：71289-5G），储存于 RT
磷酸盐缓冲盐水（10 × PBS）（Fisher Scientific，目录号：BP661-10），储存在 RT
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Millipore Sigma，目录号：S5761-500G），在室温下储存，在溶液中时储存在 4°C
二甲基亚砜（DMSO）（Millipore Sigma，目录号：D8418），储存于室温
Cy3 N-羟基琥珀酰亚胺酯单活性染料包（VWR，目录号：95017-373），储存在-20°C
CF640R琥珀酰亚胺酯（ Biotium ，目录号：92108），储存于-20°C
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Millipore Sigma，目录号：S5761-500G），在室温下储存，在溶液中时储存在 4°C
1 × PBS（见食谱）

H-128 细胞培养
100 mm 组织培养皿（VWR，CELLSTAR，目录号：82050-546）
血清移液管聚苯乙烯 10 mL（VWR，目录号：82050-482（CS））
1 L 玻璃量筒（CSU 化学储藏室）
HeLa Flp -in H9 细胞 (H-128) (由 Edouard Bertrand 博士 ( Tantale ) 友情提供等。 , 2016), 在-80 °C 下储存, 并在培养中保持在 37 °C)
Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM），高葡萄糖，无谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：11960-044），储存于 4°C
L-谷氨酰胺（L-glut）（200 mM）-100 × （Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081），储存在-20°C
青霉素链霉素（P/S）（10,000 U/mL）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122），储存在-20°C
胎牛血清（FBS），100％美国原产（Atlas Biologicals，目录号：F-0050-A），储存于-20°C
潮霉素B（Gold Biotechnology，目录号：H-270-1），储存在-20°C
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红（Thermo Fisher Scientific，目录号：25300062，长期储存在-20°C，经常使用时储存在4°C）
DMEM 维持 H-128 细胞（见食谱）
DMEM 对 H-128 细胞进行成像（参见食谱）
转录抑制剂配方（见配方）

将 CTD-RNAP2-CF640 和 Ser5ph-RNAP2-Cy3 Fab 加载到活的 H-128 细胞中
玻璃底培养皿（35 mm，14 mm 玻璃）（ MatTek Corporation，目录号：P35G-1.5-14-C）。
染料偶联 Fab “CTD-RNAP2-CF640 & Ser5ph-RNAP2-Cy3”（详见材料和程序部分 A），4 °C 储存
μm玻璃珠的定制珠子装载机[请参阅我们的珠子装载协议 ( Cialek ) 中的详细信息等。 , 2021)]。
DMEM 中高葡萄糖，无谷氨酰胺，无酚红（Thermo Fisher Scientific，目录号：31053-028），储存于 4°C

成像
雷公藤内酯，雷公藤（ Millipore Sigma，目录号：645900），储存于-20°C
Flavopiridol ，Alvocidib（Selleck Chemicals，目录号：S1230），储存在-20°C
THZ1 2HCl，CDK7抑制剂（Selleck Chemicals，目录号：S7549），储存在-20°C
注意：上述抑制剂在储存前在 DMSO 中复溶。

设备

摇杆/旋转器（Thermo Fisher Scientific，型号： HulaMixer PRS-5/12，目录号：15920D）
Arduino Uno-R3（ SparkFun Electronics，目录号：DEV-11021）和迷你转子（ SparkFun Electronics，Servo-Generic Sub-Micro Size，目录号：ROB-09065）
组织培养 CO 2培养箱（Heraeus，型号： Heracell 150）
台式离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge 20）
能够冷却的台式离心机（Thermo Fisher Scientific，型号： Accusping Micro 17R，和/或带有 F14 6x250LE 的Sorvall Legend XFR）
紫外可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号： NanoDrop OneC ，目录号：ND-ONE-W)
生物安全柜（ Nuaire ，型号：Class II type A/B3, NU-425-400）
TC20 自动细胞计数器（Bio-Rad，目录号：145-0102）
纯水过滤（Thermo Fisher Scientific，型号：Barnstead NANOpure II）
数字水浴（Fisher Scientific，型号：ISOTEMP 210）
具有高度倾斜照明和台顶培养箱的荧光显微镜（我们使用了我们定制的显微镜（Forero-Quintero等人，2021））
Mathworks的笔记本电脑或台式电脑 MATLAB

软件

使用 Fiji ImageJ (Schindelin et al. , 2012) ( https://fiji.sc/ )预处理图像
https://www.wolfram.com/mathematica/ )编写的定制代码分析预处理图像，可在https://github.com/MunskyGroup/Forero_2020/tree/master/获得生物协议_代码。
模型识别脚本和模型探索图形用户界面 (GUI) 是使用 MATLAB R2019b ( https://www.mathworks.com/products/matlab.html ) 创建的，可在https://github.com/MunskyGroup/获得Forero_2020/tree/master/Bioprotocol_Codes 。

程序

CTD-RNAP2 和 Ser5ph-RNAP2 抗体片段化和染料偶联（参见图 2 了解该制备中的主要步骤）
使用Pierce Mouse IgG1 Fab 和 F(ab')2 制备试剂盒对 Fab 进行片段化。
请遵循制造商提供的说明，网址为： https ://assets.fishersci.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0011653_Pierce_Mouse_IgG1_Fab_Fab2_Prep_UG.pdf 。
根据上述制造商的方案，我们对CTD-RNAP2 和/或 Ser5ph-RNAP2 抗体片段化过程使用了以下条件，从而产生了优质/浓缩的Fab。
从IgG 样品制备开始。重复Zeba Spin Desalting Column 的离心步骤 [此柱包含在 Pierce Mouse IgG1 Fab 和 F(ab')2 制备试剂盒中，请参阅上述步骤 A.1.a. 中的详细信息] 使用 1 mL 消化缓冲液四次。
以制造商推荐的最大浓度 ( 4 mg )在 1 × PBS 中加入 0.5 mL CTD-RNAP2 或 Ser5ph-RNAP2 全长抗体。
重要笔记：
(1) CTD-RNAP2 和 Ser5ph-RNAP2 Fab 的制备应在不同的日子完成，因为该试剂盒仅提供单个NAb蛋白柱。该色谱柱最多可重复使用十次，用于不同的抗体，只要每次使用后正确再生即可。
(2) 我们使用高浓度的 CTD-RNAP2 & Ser5ph-RNAP2 抗体，但如果您购买的是商业抗体（通常以 1 mg/mL 提供），您应该在生成和纯化 Fab 之前将抗体浓缩到更高浓度（见详情关于如何在Koch 等人的 2021 年集中抗体）。
在离心柱管中平衡固定化无花果素后，加入上述步骤 (A.1.b.ii.) 中获得的 IgG 样品，并在恒定混合下孵育消化反应4 小时（或 5 小时以获得更好的消化）树脂在 37 °C。
笔记：制造商建议使用端对端混合器或桌面摇杆，但有时这些不适合 37 °C 培养箱。为了能够在孵化过程中保持树脂不断混合，我们使用了一个迷你转子，并使用Arduino 将其编程为 360° 旋转，并将其放入我们的 37°C 组织培养箱中。
将NAb蛋白 A 柱在室温下平衡约 30 分钟。然后，按照制造商的指示执行纯化过程。这个过程涉及几个洗涤和洗脱步骤，在这些步骤中抗体可能会丢失。因此，我们建议将洗涤和洗脱步骤产生的流出物分开保存。
使用 280 nm 处的吸光度测量 Fab 的浓度以及流通量。我们使用 nanodrop，但任何其他分光光度计或 BCA 蛋白质测定都可以。
注意：使用此协议生成的 Fab 产生 50 kDa Fab，相当于全长抗体的三分之一。因此，如果抗体的起始质量为 4 mg，它将产生 2.67 mg Fab。然而，在消化和纯化过程中，一些抗体会丢失，导致 1 – 2 mg Fab 质量。在许多情况下，消化和纯化后 0.8 mg 以上的 Fab 质量仍然可以产生高质量的 Fab（足以浓缩、标记，然后可视化转录过程）。
不要忘记在完成纯化步骤后再生NAb蛋白 A 柱以便能够重复使用。将色谱柱放回 4 °C 的 1 × PBS 中，含 0.02%叠氮化钠）。
晶圆厂浓度。
将Fab和从洗涤 1 和 2 到 3 mL 的流通 Fab 添加到带有纤维素膜的Amicon Ultracel-4 离心过滤装置中，并在 7,500 × g和 4 °C 下离心 20 分钟。
注意：如果纯化后测量的浓度在 0.8 和 1.5 mg/ mL之间，则在纯化过程后将 Fab 和来自洗涤 1 和 2 的流通Fab 混合有助于增加Fab的浓度。
× PBS清洗包含 Fab 的 15 mL 锥形管，以在过滤器单元中完成 3 mL。在 7,500 × g和 4 °C 下再离心 20 分钟。
取回过滤器单元保留的溶液。这就是浓缩的Fab 。
测量 Nanodrop 中浓缩 Fab 的浓度。
另一种浓缩 Fab 的方法是使用Amicon Ultracel-10 filter 0.5 离心装置：
将 Fab 和从洗涤液中流出的 Fab 混合，并在12，000 × g和 4°C下一次旋转 0.5 mL 5 分钟，直到所有体积（~3 mL）都流过。
含有 Fab 的一些体积将保留在过滤器单元中，加入足量的 1x PBS 至 0.5 mL，在12,000 × g和 4 °C 下离心 5 分钟。重复此步骤一次。
再重复一次步骤 (A.2.e.ii.)，但现在持续 20 分钟。
小心地将过滤器单元翻转到 1.7 mL 低结合管中，并在300 × g和 4 °C 下离心 1 分钟。
加入 30 μL的 1 × PBS 清洗过滤器单元，并按照步骤 ( A.2.E.iv. ) 再次离心。
使用 nanodrop 测量浓度。
纯化的非共轭 Fab 可储存在 4°C 直至使用。如果储存得当，它可以持续长达一两年而不会降解。
Fabs 染料共轭。
获得纯化和浓缩的 Fab 蛋白。
每个蛋白质使用一个低结合管。
在一个 0.6-mL 低结合管中，混合：10 μL 1 M NaHCO 3 （效果更佳，新鲜配制）与100 μg纯化的Fab蛋白，加入1 × PBS使总体积为100 μL 。注意：例如，如果纯化的 Fab 蛋白浓度为 1.8 mg/mL，则 100 μg对应于55.5 μL 。因此，混合物将由 55.5 μL纯化的 Fab 蛋白、 10 μL 1 M NaHCO 3和 34.5 μL 1 × PBS 组成，总体积为100 μL 。
添加正确数量的染料。使用 2 μ L的 1 μ M CF640 和 2.66 μ L的 1 μ M Cy3（两种染料之前都在 DMSO 中稀释过）。将染料添加到各自的混合物（CF640 到 CTD-RNAP2，Cy3 到 Ser5ph-RNAP2）后，上下移液器，轻敲试管以均匀分布混合物。然后，在 RT 孵育并避光 2 小时，同时在旋转器中不断旋转混合物。
使用 G-25 mini trap 脱盐柱纯化染料偶联的 Fab（每个偶联的 Fab 蛋白使用一个）。
丢弃迷你捕集柱中的缓冲液并用 1 × PBS 替换（重复此步骤 3 次以进行平衡）。
平衡柱子后，取出孵育的混合物（包含标记的 Fab），并将其添加到迷你捕集柱的顶部（确保它居中且笔直）。加入 450 μL的 1 × PBS进行循环（从上方加入，不要接触 mini trap 柱的侧面）。
笔记：与染料结合的 Fab 蛋白比未结合的要重；因此，它会更快地通过迷你捕集柱。您将能够看到两个单独的条带形成。较低的包含您的共轭 Fab。
如果所需条带靠近 mini trap 柱的底部，则添加 50 μ L的 1 × PBS；如果离底部较远，添加 100 μ L的 1 × PBS。这将有助于降低共轭 Fab。
注意：请仔细查看 mini trap 柱，因为您要确保捕获结合的 Fab。
开始将离心机冷却至 4°C。
为每个结合的 Fab 获取一个 1.7 mL 低结合管，将其放置在相应的 mini trap 柱下方，并添加 500 μ L的 1 × PBS。
注意：仔细观察，因为此步骤将逐滴降低所有共轭 Fab。
将上述步骤 (A.3.ev) 产生的共轭 Fab 添加到Amicon Ultracel-10 (10 kDa -cutoff) 0.5 离心过滤器单元的顶部（该过滤器允许小于 10 kDa的蛋白质）。在 12,000 × g和 4 °C 下离心 5分钟，弃去流出液。
注意：将过滤器与离心机垂直对齐，这样蛋白质就不会直接离心进入过滤器。
加入 500 μ L的 1 × PBS，在 12,000 × g和 4 °C 下再离心 5分钟，弃掉流出液。
重复上述步骤（A.3.e.vii.），但现在离心 10 分钟。
注意：如果您的流出液有颜色，则表示过滤器可能有缺陷。流出物应该是透明的，这意味着您的偶联 Fab 保留在过滤器中，并且流出物是一次性的。
取出含有共轭 Fab 的过滤器，将其紧紧放置在其顶部的 1.7 mL 低结合管中，然后翻转。以 300 × g和 RT离心2 分钟。
测量每种蛋白质的浓度和吸收光谱以计算标记程度。
使用纳米滴或其他分光光度计来测量吸收光谱。选择 IgG 作为样品类型，并选择相应的染料（CF640 或 Cy3）。理想情况下，蛋白质的浓度应高于 1 mg/mL，吸光度比应高于 1.2。
使用以下公式计算 Fab 的标记度 (DOL)：
DOL=ε_IgG/ε_dye × 1/((A_fab/A_dye )^(-1)-CF)

其中ε IgG和 ε染料是 Fab 蛋白 (IgG) 在 280 nm (83,000 M -1 cm -1 ) 和染料 ( Cy3 为150,000 M -1 cm -1和CF640 为105,000 M -1 cm -1 ) 的消光系数，分别）。这些数字由制造商提供。一个工厂 A Dye是 IgG 蛋白在 280 nm 处测定的吸光度， Cy3 是 550 nm 处测定的吸光度，CF640 是 650 nm 处测定的吸光度，CF 是 280 nm 处染料的校正因子（Cy3 为 0.08 和 0.37，和 CF640 分别由制造商提供）。将标记的 Fab 在4°C 下储存长达一年左右。
注意：在我们的研究中（Forero-Quintero等人，2021 年），DOL 介于 0.75 和 1 之间的 Fab 成功地用于实时成像实验。

图 2.片段化、标记和浓缩抗体的主要步骤。
（左），消化针对所需蛋白质修饰的完整单克隆抗体 ( mAB )，然后使用Pierce Mouse IgG1 Fab 和 F(ab')2 制备试剂盒将 Fab 片段化（程序 A.1）分离 Fab。如程序 A.2 所述，使用Amicon Ultracel-4 或 -10 过滤器单元浓缩分离的 Fab。（右），通过组装包含纯化的 Fab、NaHCO 3 、PBS 和染料的反应，将纯化和浓缩的 Fab 与所需的荧光染料结合。如程序 A.3 中所述，纯化和浓缩染料结合的 Fab。

H-128 细胞培养
准备 DMEM 以维持 H-128 细胞（请参阅“食谱”部分中的详细信息）。
2的培养箱中，细胞在补充的 DMEM 培养基（参见下面的配方 2）中保持不超过 95% 的融合度。
注意：在培养一批新细胞之前，细胞最多通过 25 次。细胞分裂最多每周进行两次，以避免由于胰蛋白酶消化过程对细胞造成压力。
在进行成像实验的前一天，将细胞放入MatTek培养皿中，如下所示：
预热 0.05% 胰蛋白酶原液，并补充 DMEM 以维持 H-128 细胞。
将 100 毫米培养皿从培养箱转移到组织培养罩。
取出所有介质。
× PBS清洗细胞三次。
添加 4 mL 的 0.05% 胰蛋白酶以覆盖 100 毫米盘子的表面。让它在 RT 中放置大约 40 s，然后用吸气器去除胰蛋白酶。会留下一层薄薄的。
将细胞放回培养箱中 5分钟。孵化后，轻敲培养皿的底部和边缘，将细胞从培养皿底部分离和分离。
使用光学显微镜观察细胞，以确认细胞分离和单一化。
在盘子中加入 10 mL 的补充 DMEM 培养基。使用 10 mL 血清移液器，上下移取悬浮液中的细胞，将移液器的尖端靠在培养皿的边缘，以分解在敲击细胞时没有单一化的细胞簇或细胞群。为了确保培养皿底部的所有细胞都在悬浮液中，倾斜培养皿，让细胞和培养基的混合物在培养皿中从不同的角度流动，同时上下移液。
μL的悬浮液体积，并使用细胞计数器对细胞进行计数。
MatTek的玻璃底部区域放置足够的细胞以达到 1.5 × 10 5 个细胞/ mL 的最终浓度。在添加补充的 DMEM 培养基之前，让重新悬浮的细胞在玻璃区域上站立几秒钟。维持 H-128 细胞需要大约 0.8 mL 悬浮细胞（3 × 10 5 个细胞/mL）和 1.2 mL 补充 DMEM 培养基。该比率导致细胞与珠子负载缀合的 Fab 的良好汇合。
将MatTek腔室中的细胞放回 37°C、5% CO 2培养箱中，让它们至少静置 24 小时，然后再进行任何进一步的程序。

将 CTD-RNAP2-CF640 和 Ser5ph-RNAP2-Cy3 Fab 加载到活的 H-128 细胞中
构建您自己的珠子装载器，包括 106 μm玻璃珠、100 μm尼龙网 [ Spectramesh编织过滤器聚丙烯开口：105-μm（Spectrum Labs，目录号：148496） ]，以及去除玻璃底部的MatTek盘[见恰莱克等。（2021）和科赫等人。（2021 年）有关施工的详细信息]。
在您的工作台上，放置一个 0.6 mL 低结合管，并混合：
~0.75 μg CTD-RNAP2-CF640 蛋白 Fab（约 1 μL在程序步骤 A 中获得的缀合 Fab）。
~0.5 μg Ser5ph-RNAP2-Cy3 蛋白 Fab（约 1 μL在程序步骤 A 中获得的缀合 Fab）。
将 1 × PBS 添加到 4 μL的总体积中。
注意：旋转含有偶联Fab 的管子，并通过上下移液器充分混合，然后取出混合物的体积。根据偶联 Fab 的浓度，只要保持浓度，您最多可以使用 10 μL上述混合物。
通过上下吹打充分混合，但避免在混合物中产生气泡。减速。
开始加热 50 mL 的 DMEM 培养基以成像 H-128 细胞（参见下面的配方 3），无需 (DMEM - ) 和 (DMEM + ) 补充剂。
注意：此 DMEM 不含红色苯酚，便于成像。
将以下物品放入细胞培养罩中，并在其中执行以下步骤：
定制的珠子装载机 [要查看珠子装载机结构和程序的详细说明，请参阅我们最近的出版物(Cialek et al ., 2021) ]。
缀合的 Fab 的混合物（如上所述）。
每个腔室一个 15 mL 的锥形管，将装入珠子。
的MatTek室（至少在 24 小时前电镀）。
将 4 μL的共轭 Fab 装入移液器尖端，并将其放在一边。从MatTek中取出所有培养基（包括玻璃底部区域边缘周围的残留物，以确保细胞不会被移液器吸头报废）室，并将其放在 15 mL 锥形管中。
注意：去除所有培养基很重要，尤其是在玻璃区域周围，因为即使是最小的残留物也可能 (1) 影响添加的共轭 Fab 的浓度，以及 (2) 珠子可能漂浮在该培养基上，因此不会进入直接接触细胞。
将 4 μL共轭 Fab 混合物直接添加到细胞顶部，就在玻璃底部区域的中心。
紧接着，将定制的珠子装载机放在MatTek室的顶部，轻轻地将玻璃珠洒在细胞顶部，将两个室贴在工作台上一次。
搁置定制的珠子装载机。
轻敲MatTek室 7 – 10 次，使用足够的强度让玻璃珠对细胞膜施加力并让 Fab 进入，但要足够轻柔，以免细胞从玻璃上剥落。
笔记：
(1) 与电穿孔类似，微珠加载技术通过机械力在细胞膜中诱导微小的撕裂，这使得结合的 Fabs 通过这些微小的撕裂扩散到细胞中。这种技术不会影响细胞活力，并且细胞会在手术后数小时内恢复。
(2) 某些细胞类型比其他细胞类型更容易剥离，特别是如果它们不直接附着在玻璃上并且需要对玻璃进行一些预处理，如层粘连蛋白或聚赖氨酸，在这种情况下，珠加载可能会起作用，但是敲击强度必须通过实验确定。
轻轻地将步骤 (C.5.) 中去除的培养基通过腔室的一侧倒回细胞中，而不是直接倒在细胞顶部，确保不会干扰细胞。
将细胞放回 37°C、5% CO 2的培养箱中，让细胞恢复至少 1 小时。
将细胞带回引擎盖并取出培养基。通过一次添加 1 mL 的 DMEM 清洗玻璃珠，并将溶液倒入液体废物容器中。根据需要重复多次，直到大部分玻璃珠消失。使用光学显微镜目视确认相对较少的珠子剩余。
注意：倾斜MatTek腔室将有助于将珠子降低到盖玻片部分的边缘，在那里它们可以用移液器吸头吸出。
删除最后添加的 DMEM -并添加 2 mL 的 DMEM + 。将细胞放回 37 °C、5% CO 2的培养箱中。让他们在开始成像之前再完全恢复 4 小时。注意：根据我们的经验，我们观察到细胞完全恢复并显示与 RNAP2 5 h post-bead loading共定位的活性转录位点。要查看珠加载协议及其应用的详细说明，请参阅我们最近的出版物（ Cialek等人，2021 年）。

成像
成像可以在配备有 488、561 和 637 nm 激光器的显微镜上进行，该激光器带有适当的滤光片、一个将细胞保持在 37 °C、5% CO 2和敏感 EM-CCD 相机的台顶培养箱。我们建议使用具有高度倾斜照明 (HILO) 的宽场荧光显微镜 (Tokunaga et al. , 2008)，以便更好地观察背景上方的活跃和非活跃转录位点。
将细胞放在舞台顶部培养箱（37 °C，5% CO 2 ）上。
根据所研究基因的激活率（测量或预期）定义成像条件。
设置成像实验以覆盖整个细胞核。对于 H-128 (HeLa) 电池，13 个间距为0.5 μm的z 堆叠就足够了。
笔记：
(1) 捕获整个细胞核对于更精确地研究转录动力学很重要，并保证当转录位点消失时，这不是由于它超出了记录区域，而是由于失活期造成的。
(2) 我们使用的 Z 范围从上到下覆盖了 HeLa、U-2 OS、HEK293、RPE1 和成纤维细胞。
根据感兴趣的基因的激活率和/或您希望观察的事件类型设置时间间隔。
为了可视化转录波动，您可以根据您感兴趣的基因以分钟为单位设置成像实验。我们的 HIV-1 报告基因的转录位点表现出在微小范围内的波动。因此，我们做了一个简短的活细胞成像组，其中每个细胞每分钟成像一次，持续 30 分钟。在这种类型的实验中，我们能够观察到 mRNA、CTD-RNAP2 和 Ser5ph-RNAP2 转录波动很好地相关；然而，我们无法在单个细胞记录中观察到多个转录周期（多个活跃期和非活跃期）。
要可视化基因的多个转录活跃期和非活跃期，您应该以小时为单位设置成像实验，并根据测量的总长度，将每个细胞的扫描设置为每 1 分钟或几分钟.如果您的电影持续数小时，您也可以降低激光功率。改变这两个条件将有助于防止荧光探针的光漂白和电影过程中的细胞损伤。在我们的系统中，我们记录细胞的时间更长；每个细胞每 1 分钟成像 200 个时间点（约 3 小时 20 分钟），覆盖整个细胞（视频 1 中显示了代表性记录）。在我们的 HIV-1 报告基因中，mRNA 信号很少完全消失，然而，更长的电影让我们能够在我们的一些细胞中看到这些罕见的事件。在某些情况下，mRNA、Ser5ph-RNAP2 和 CTD-RNAP2 信号在一部电影中最多打开和关闭四次，其中 RNAP2 信号出现的时间略早于 mRNA，表明转录爆发和多个完整的转录周期。
要确定信号之间的短时间延迟，您应该将实验设置为更快的成像速率。在我们的系统中，我们观察到 HIV-1 转录位点的 CTD-RNAP2 和 Ser5ph-RNAP2 信号之间存在时间延迟。我们预计 RNAP2 的 CTD 尾部的丝氨酸 5 磷酸化会在几秒钟内发生；因此，我们无法使用我们的 1 分钟速率电影来解决我们的 RNAP2 信号之间的时间延迟。因此，我们的成像速度更快，每 150毫秒1 帧，在一个平面上总共有 10,000 个时间点（150 秒）。请注意，更快的成像仅限于单个平面，这在这种情况下没有问题，因为转录位点在 z 平面之间不会以秒为单位移动太多。
添加雷公藤甲素以测试主动转录。
设置成像实验以捕获整个细胞（13 个 z 堆叠，间距为 0.5 μm ），每 1 分钟扫描每个细胞 35 分钟。
获取五个时间点。
在前五个时间点后，将最终浓度为 5 μM的雷公藤内酯直接添加到腔室顶部。
笔记：
(1) 对于药物实验，我们通常从MatTek室中取出 1 mL DMEM +培养基，然后将其安装到显微镜培养箱上，并保持在 37°C。在将刺激物添加到细胞前几秒钟，将雷公藤甲素添加到保留的 DMEM +中，充分混合，然后将混合物添加到细胞中。
(2) 将混合物加入细胞时，确保不要接触腔室；否则，您的视野将失去焦点并被改变。
添加雷公藤内酯后，继续对细胞进行 30 个时间点（30 分钟）的成像。
注意：在我们的 HIV-1 报告基因的转录位点添加雷公藤内酯后，活性转录位点和 RNAP2 Fab 信号会在 5-10 分钟内消失。成熟 mRNA 的降解以数小时为单位发生。雷公藤内酯实验有助于确定大小和亮度合适的核点是否是活跃的转录位点。
添加 THZ1 和flavopiridol以抑制转录周期的后期步骤（分别为起始和延伸）。
设置您的成像实验以捕获整个细胞（13 个 z 堆叠，间距为 0.5-μm），每 1 分钟扫描每个细胞 35 或 55 分钟，分别用于黄酮哌啶醇和THZ1。注意： THZ1 需要 20-25 分钟才能完全抑制转录起始，进而抑制 mRNA 合成。出于这个原因，我们进行了长时间的成像，因此我们可以在我们的 HIV-1 报告基因的转录位点看到完全的转录起始抑制。
获取五个时间点。
在前五个时间点之后，将最终浓度为 15 μM的 THZ1或最终浓度为 1 μM的flavopiridol添加到腔室顶部，如上所述。
加入 THZ1 后继续对细胞成像 55 个时间点（55 分钟），加入黄酮吡啶后继续成像 30 个时间点（30 分钟）。

视频 1. 处理后的长时间成像过程中的代表性 3 色电影。
13 z 堆叠三色电影的最大投影，代表示例性 H-128 细胞。白色虚线圆圈显示 HIV-1 报告基因的转录位点，其中 mRNA、CTD-RNAP2 和 Ser5ph-RNAP2 信号共定位。图像每 1 分钟采集一次，总共 200 分钟。视场为 512 x 512 像素 = 66.56 μm × 66.56微米。比例尺，10 μm 。
数据分析
图像处理和信号量化：
校正每个中的光漂白和激光波动的 3D 图像 z 堆栈，通过将影片除以每个通道中整个细胞或细胞核的平均强度来创建新的校正 3D 影片。我们使用 Mathematica 中的脚本来执行此任务。该代码可在 https://github.com/MunskyGroup/Forero_2020/tree/master/Bioprotocol_Codes ，另存为“ BleachCorrectionZ_bioprotocol ”。
注意：在此步骤中构建掩码需要最大图像的最大值（通过 z 创建最大投影，然后及时创建 z 最大投影的最大投影）。使用 Fiji ImageJ max-projection 可以直接创建最大投影（有关详细信息，请参见图 3）。
使用 Fiji ImageJ，从步骤 E.1.a 预处理校正的 3D 电影。（有关如何创建以下文件的进一步说明，请参见图 3），以及：
从每个通道中减去背景强度。
通过 z 创建一个 2D 最大投影。
在 z 中创建 2D 最大投影的时间最大投影（来自步骤 E.1.b.ii）。
将 3D 图像序列保存在以单元格编号命名的文件夹中。

图 3. 图像预处理管道。
该流程图显示了如何使用我们在 Mathematica 中定制的脚本来预处理 3D 电影以生成量化转录位点强度信号所需的文件。

注意：我们使用 Mathematica 编写的自定义代码执行了以下步骤（E.1.c – E.1.l）中描述的任务，保存为“ TranscriptionSiteTrackingCode_Bioprotocol ”，可在Github上https://github.com/ MunskyGroup/Forero_2020/tree/master/Bioprotocol_Codes 。

创建一个描绘细胞核的面具。
笔记：使用 z 中 2D 最大投影的最大投影时间（“最大图像的最大值”）。
可选：如果信噪比很差，最好创建一个随时间推移的平均投影（使用几帧，~3）。
选择每个通道中的阈值以可视化转录位点处的点，并选择带通滤波器以仅突出显示 mRNA 通道中的转录位点。
将步骤 E.1.e 中生成的图像二值化。
随着时间的推移跟踪转录站点。您可以使用Trackmate (Tinevez et al. , 2017)斐济插件，或创建您自己的跟踪程序。我们使用ComponentMeasurements-IntensityCentroid内置的 Mathematica 例程以及我们的点击和跟踪功能随时间跟踪转录位点，这使我们能够通过时间找到 XY 坐标。
为每个时间点创建两个掩码：一个标记转录位点 (TS)，一个标记背景 (BG)。
使用 3D 图像序列（在步骤 E.1.b.iv. 中创建的文件夹），确定 XY 中的转录位点具有最大值（“最佳 z”）的 Z 坐标或 z 堆栈。
注意：如果转录位点因转录失活或抑制而消失，则没有信号残留的 Z 或 Z 将替换为最后一个可见位置的 Z 坐标。
考虑到步骤 E.1.i 中的“最佳 z”，从 XYZ 坐标计算新的 2D 最大投影。在每个时间点。
使用步骤 E.1.h 中所述创建的 TS 和 BG 掩码计算转录位点和背景随时间变化的平均强度值。
注意：我们使用三个点的移动平均值来计算每个通道的原始强度和归一化强度向量，以显示原始强度随时间的变化，我们通过将原始强度除以所有转录的平均 95% 强度来计算归一化强度网站。
要随时间显示转录站点，请从每个通道中的“最佳 z”生成 3 时间点移动平均修剪的裁剪图像。将每个修剪与 mRNA 通道中转录位点的强度质心居中。我们展示了 CTD-RNAP2、Ser5ph-RNAP2、mRNA 和合并。
笔记：
(1) 我们的 Mathematica 脚本“ TranscriptionSiteTrackingCode_Bioprotocol ”可以使用与视频 1 对应的原始原始电影（除了光漂白和激光波动校正外不进行处理）进行测试。电影保存为“SupFig3a_PBC_Cell14_woProj_ExemplaryCell.tif”，可在https： //doi.org/10.6084/m9.figshare.14187011 [为我们的原始出版物（Forero-Quintero等人，2021 年）创建的存储库，该协议来源于此]。我们还提供了在同一存储库中保存为“Beads02.tif”的珠子图像，以校正相机偏移。
(2) 我们计算了转录位点每个通道随时间推移的原始平均强度，包括每个细胞的背景扣除，没有运行平均，并保存一个文件，收集所有分析的细胞的所有数据为“ Raw_Intensities Analysis-BLC_W_BG_WO_RunAve_Date.XLS ”。然后在步骤 E.2 中使用该文件。
可以从上述步骤中分析的数据中提取的生物物理参数：
XYZ 转录位点随时间的位置而没有 Z 中的广义最大投影 [参见 Sup.原始论文（ Forero -Quintero等人，2021 年）中的图 3d ，该协议源自该论文]。
整个转录周期的转录动力学（通过 CTD-RNAP2、Ser5ph-RNAP2、转录位点的 mRNA 强度信号，图 4）。

图 4. 信号量化后的代表性数据。
视频 1 中显示的示例性 3D 电影随时间的标准化信号强度。信号在转录位点共同定位，并代表CTD-RNAP2（红色圆圈）、Ser5ph-RNAP2（绿色方块）和 mRNA（蓝色菱形）。图改编自Forero -Quintero等人。（2021 年）。

转录不活跃时的最小信号分析 [参见原始论文( Forero -Quintero et al ., 2021)中的图 2d ]。
通过时间和转录周期分析转录位点空间组织[见图2e-h，Sup。图 3h 和 Sup。原始论文中的图 4 ( Forero -Quintero et al ., 2021) ]。
注意：我们的“ TranscriptionSiteTrackingCode_Bioprotocol ”包括一个距离分析选项卡，可以根据您的目的针对此量化进行调整。
量化每个转录位点的 mRNA 数量 [参见原始论文中的图 3d ( Forero -Quintero et al ., 2021) ]。
CTD-RNAP2、Ser5ph-RNAP2 强度信号和转录位点 mRNA 计数的概率分布 [参见原始论文中的图 3d ( Forero -Quintero et 等人，2021 年） ]。
CTD-RNAP2、Ser5ph-RNAP2 和 mRNA 信号转录位点的自相关和互相关 [参见原始论文中的图 3a-b ( Forero -Quintero et al ., 2021) ]。
在转录周期的不同步骤中对转录抑制的转录反应 [参见原始论文中的图 4 ( Forero -Quintero et al ., 2021) ]。
请参阅我们的原始论文 ( Forero -Quintero et al. , 2021)，了解有关数据包含/排除标准的详细信息、每个实验中重复次数的详细信息以及统计检验。

转录的定量模型
下载 Forero2020/ Bioprotocol_Codes / 从： https ://github.com/MunskyGroup/Forero_2020/tree/master/Bioprotocol_Codes 。
从 XLS 文件（在我们的示例中命名为“ Raw_Intensities Analysis-BLC_W_BG_WO_RunAve_Date.XLS”）加载轨迹数据并标准化强度和相关性（“ ComputationalProtocol.m ”中的第 1 节）。
强度数据的格式应使其包含每个通道的一列和（时间点数） × （单元格数）行，其中每个后续单元格垂直附加，
例如，具有 20 个 200 分钟轨迹的单元的 3 个通道应具有 4000 行× 3 列的形状。
如果需要，更改强度归一化选项：
默认设置是最小 0 和最大 1.5，归一化到每个强度轨迹的第 95个百分位数。
更改相关长度和归一化选项：
默认设置线性插值以找到零滞后自相关G(τ=0) 然后平均所有单元格以找到¯(G (τ=0)) 对于每个信号。这提供了去除散粒噪声后的方差估计。对每个单元分别计算互相关，然后除以零滞后时间的平均相关。默认情况下，互相关的延迟为 -10 到 +10 分钟，自相关的延迟为 0 到 30分钟。
定义模型（“ ComputationalProtocol.m ”中的第 2 节）。
指定状态数。
指定参数和噪声的数量和初始猜测。
指定化学计量矩阵、S 和仿射线性倾向函数 W = W1*x + W0。
指定强度变换矩阵，c。
有关制定爆破模型的更多详细信息，请参见方法。 Forero-Quintero等人描述了替代模型。（ 2021 年，上图 6）。
求解模型以计算指定时间点的稳态均值、方差、自相关和互相关（“ ComputationalProtocol.m ”中的第 3 节）。
Forero-Quintero等人提供了解决方法的详细信息。 (2021) ，第 9 节，方法，“转录的定量模型”。
计算给定模型的数据的对数似然（“ ComputationalProtocol.m ”中的第 4 节）。
每个通道的测量平均表达值 (' DataMeans ')、量化分子的平均值的标准误差(' DataSEMs ') 以及每个物种的转录位点数 (' Nmolecules ')。对于未量化的通道，这些值可以在代码中保留为零 (0)。在我们的原始论文(Forero-Quintero et al. , 2021)中，我们通过计算成熟 mRNA 并将它们的平均强度与报告基因的转录位点强度进行比较来确定转录位点 (' Ntranscripts ')处新生 mRNA 的数量。
指定哪些参数是固定的“ par_fixed ”，哪些参数可以根据需要更改“ par_changed ”以进行参数搜索。
进行参数搜索以识别最大似然估计 (MLE)（“ ComputationalProtocol.m ”中的第 5 节）。
我们建议使用具有多个初始猜测的遗传算法 (GA) 和fminsearch分析的 20 次或更多迭代组合，然后在这些迭代中选择最佳拟合。
计算用于模型选择的贝叶斯信息准则 (BIC) 或 Akaike 信息准则 (AIC)（“ ComputationalProtocol.m ”中的第 6 节）。
指定自由参数的数量（在我们的示例中 k=5）。
如果使用 BIC，请指定数据中估计的自由度数。我们建议保守估计为（例如，n=8）。如果使用 AIC，则无需估计自由度的数量。
运行 Metropolis Hastings 搜索参数不确定性量化（“ ComputationalProtocol.m ”中的第 7 节）。
我们建议设置超过 50 个片段的 5,000 个样本，至少 20 个链（1000 万个样本）的细化率为 20。对于提案函数，我们建议使用方差选择为每个参数的3% – 5%的 N 维高斯函数。
绘制相关拟合（“ ComputationalProtocol.m ”中的第 8 节）。
附加分析（ “ ComputationalProtocol.m ”中的第 9 – 12节）。
样本模型强度。
比较模型和数据强度直方图。
从模型中预测ChIP 。
预测扰动分析。

食谱

1 × PBS
带入细胞培养罩：
10 × PBS [将全部 PBS 粉末浓缩物加入到来自 Milli Q 的 1 L 超纯水中，并适当混合。确保 pH 值约为 7.4，然后使用Steritop螺纹瓶顶过滤器 (0.22 µm) 过滤溶液]。
四个高压灭菌瓶 (500 mL)。
Nanopure的 900 mL 超纯水。
封口膜。
Steritop螺纹瓶顶过滤器（用于 500 mL）。
将 100 mL 的 10 × PBS 添加到 1 L 量筒中的 Milli Q 的 900 mL 超纯水中，用封口膜覆盖，并适当混合。打开一个新的Steritop螺纹瓶顶过滤器，将其放入第一个瓶中，加入 500 mL 溶液，打开真空，然后塞住软管。
注意：为了充分利用过滤器，一次制作 3 L 的 1 × PBS。
储存在 RT 直到使用。它在货架上可以保存几个月。
DMEM 维持 H-128 细胞
解冻 50 mL 的 FBS、5 mL 的 P/S 和 5 mL 的 L-glut。将它们添加到 500 mL 的 DMEM、高葡萄糖、无谷氨酰胺、红酚中，并混合均匀。储存在 4°C 直至使用。
将上述补充培养基制成 50 mL 等分试样，加入 150 μL潮霉素（之前在 Milli-Q 的超纯水中稀释，浓度为 50 mg/mL），以获得 150 μg /mL 的潮霉素最终浓度在介质中。
注意：潮霉素是维持 H-128 稳定细胞系中 HIV-1 报告基因的表达所必需的。培养基中添加潮霉素后，两周内用完，不用时4℃保存。
DMEM 对 H-128 细胞进行成像
遵循与上述相同的说明（配方 2），但现在使用 DMEM、高葡萄糖、无谷氨酰胺、无红酚。
注意：需要清晰的介质以保证清晰的荧光图像。储存在 4°C。妥善储存后可稳定数周。
转录抑制剂
将 555 μL的 DMSO 添加到雷公藤内酯 (TPL, 1 mg) 的全部内容中, 并充分混合, 以获得 5 mM 的库存浓度。
将 6.2214 mL 的 DMSO 添加到Flavopiridol (Flav, 5 mg) 的全部内容中, 并充分混合, 以获得 2 mM 的库存浓度。
将 3.9125 mL 的 DMSO 添加到 THZ1（5 mg）的全部内容中，并充分混合，以获得 2 mM 的库存浓度。
注意：不使用时，将所有抑制剂储存在 -20°C。

致谢

Stasevich和Munsky实验室的所有成员的支持以及有益的讨论和建议。 TJS 得到 NIH（授权号 R35GM119728）和 NSF（授权号MCB-1845761 ）的支持。 LSFQ、BM 和 WR 得到了 NIH 的支持（授权号 R35GM124747），LSFQ 也得到了 WM Keck 基金会的支持。该协议源自Forero -Quintero等人发表的作品。（2021 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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