材料和试剂

1. 牙签
2. 细菌培养管（MTC BIO，目录号： T8235）
3. 15 mL 管（VWR，目录号： 525-1070）
4. 0.5 mL微管，黑色DNase RNase免费（ARGOS，目录号： T7456-001）
5. 质粒 pET-30a 和质粒 pET-CCHFNP
6. Triton X-100（Fisher Bioreagents，目录号：BP151-500）
7. HisTrap FF 原油（Cytiva，目录号：17528601）
8. 高精度链霉亲和素（SAX）（ForteBio，目录号：18-0037）
9. Rosetta（DE3）感受态细胞（Millipore Sigma，目录号： 70954）
10. 硫酸卡那霉素（Fisher Scientific，目录号： BP906-5）
11. IPTG（IBI Scientific，目录号： IB02125）
12. 蛋白质阶梯（Fisher Scientific，目录号： 26616）
13. HisTrap FF 原油（Cytiva，目录号： 17528601）
14. 馏分收集器 F9-R（GE Healthcare，目录号： 29011362）
15. T7 RNA聚合酶试剂盒（Promega，目录号： P1300）
16. Biotin-11-CTP（Perkin Elmer，目录号： NEL542001EA）
17. Bradford Protein Assay Kit 4（Bio Rad，目录号： 5000204）
18. 1,000 ×卡那霉素原液（见配方）
19. 1,000 × IPTG 库存（见配方）
20. 裂解缓冲液（见配方）
21. 洗脱缓冲液（参见配方）
22. LB肉汤（见食谱）
23. LB琼脂板（见食谱）
24. 5 × SDS 上样染料（见配方）
25. SDS-PAGE（见配方）
26. 考马斯蓝染色溶液（见配方）
27. 考马斯蓝脱色溶液（见配方）
28. 生物素化 RNA （见食谱）
29. 稀释缓冲液（见配方）
30. RNA 结合缓冲液（见配方）

设备

1. 分光光度计（ Jenway，型号：6705；吸光度波长范围 190 – 1,100 nm ）
2. BLITZ 探头（ Nemko，forteBIO，型号：BLITZ ）
3. HPLC AKTA Pure 25L（GE Healthcare，Cytiva，型号：29018224）
4. Isotemp 培养箱（Fisher Scientific，目录号： 11-690-637D）
5. Excella E24 培养箱摇床系列（New Brunswick Scientific，型号：M1352-0000）
6. Allegra X-14R 离心机 (Beckman Coulter)
7. Sonicator-Sonic Dismembrator 100 型（Fisher Scientific，型号：XL2000-350）
8. Legend Micro 17 离心机（Sorvall，Thermo Scientific）
9. SDS-PAGE 凝胶电泳系统 (Bio-Rad)

软件

1. 独角兽 7 (Cytiva)
2. BlitzPro 1.2 (ForteBio)

程序

A. 质粒在 Rosetta DE3大肠杆菌细胞中的转化
1. 编码 CCHFV 核衣壳蛋白 (CCHFVNP) 的基因由 GenScript 合成，并在 pET-30a (+) 主链中的 NdeI 和 XhoI 限制性位点之间克隆。得到的质粒 (pET-CCHFNP) 以冻干粉形式从金斯瑞获得，并以 20 ng/ μL的最终浓度溶解在分子生物学级水中。该质粒表达含有 C 端 6X His 标签的 CCHFVNP。或者，可以在您自己的实验室中生成质粒。可以使用在细菌中表达感兴趣的 His 标签蛋白的任何诱导型载体。
2. 冰上解冻一小瓶感受态Rosetta (DE3) 细胞 (~75 µL )，然后将5 µL pET-CCHFNP 质粒 (20 ng/ µL )添加到小瓶中，然后将所得混合物在冰上孵育 30 分钟.
3. 将小瓶转移到 30°C 的水浴中 1.5 分钟，然后立即在冰上孵育 2 分钟。
4. 在混合物中加入 700 μL 的新鲜 LB 肉汤，并在 37°C下使用细菌摇床培养箱以 250 rpm的速度搅拌细胞 90 分钟。
5. 小心地将 100 μL 的转化罗塞塔细胞扩散到含有卡那霉素 (50 μg/mL) 的琼脂板上。有关倾倒琼脂板的信息，请参阅食谱部分。
6. 将板倒置并在 37°C 的细菌培养箱内孵育过夜。

B. 筛选细菌菌落的蛋白质表达
7. 第二天早上，识别五个孤立的菌落，并将它们标记为琼脂板背面的菌落 1、2、3、4 和 5。使用无菌牙签将五个分离的菌落从琼脂板上一一提起。将每个牙签放入含有 5 mL LB 培养基和卡那霉素（50 μg/mL）的培养管中。
8. 在 37°C 下在摇床培养箱内用恒定摇动 (250 rpm)孵育每个管子。
9. 第二天早上，为每个隔夜培养管制作两支 5 mL 的新鲜 LB 培养基管，其中含有卡那霉素 (50 µg/mL)。您最终将为五个过夜培养管制作总共十个新鲜的 LB 管。从菌落 1 中将 50 μL 的隔夜培养物添加到两个试管中，并正确标记它们以代表菌落 1。这样，您将使用初级隔夜培养物为每个菌落生成两个二次培养物。对菌落 2、3、4 和 5 重复该过程。将剩余的初级隔夜培养物保存在 4°C 以供将来接种。
10. 在 37°C下以恒定摇动（250 rpm）孵育十个新鲜制作的二次培养物2-3小时，并使用分光光度计定期检查 600 nm 的 OD 。当 OD 600达到 0.3 – 0.5 时，从培养箱中取出试管。通常需要 3 – 5 小时才能在 600 nm 处达到 0.3 – 0.5 的 OD。
11. 将 5 μL 的 IPTG 库存溶液 (1,000 × ) 添加到每个菌落的两个二次培养管之一中。不要将 IPTG 添加到另一管中，因为稍后将用作对照。
12. 在 16°C下以 250 rpm 的速度持续摇动所有管子，过夜。
13. 将过夜的二次培养物转移到新鲜的 15 mL 管中，并通过在 4,000 下离心沉淀培养物 × g和 16 °C 15 分钟。弃去上清液，保存细菌沉淀。
14. 在每个颗粒中加入 80 μL 的裂解缓冲液，然后涡旋直到颗粒分散。将裂解物转移到 1.5 mL Eppendorf 管中，并使用超声波仪在冰上以 40 kHz (>400W)声波处理混合物 5 分钟。在每管中加入 20 μL 的 5 × SDS 上样染料。将所得溶液的 15 μL 加载到 12% SDS-PAGE 凝胶中。在其中一条车道中加载 10 μL的蛋白质梯。在 100 V 下运行凝胶，直到染料前沿通过浓缩胶，之后电压可以增加到 200 V，如果您想节省时间。当您感兴趣的蛋白质到达分离凝胶的中间时，停止运行凝胶，通过观察标记泳道确定。
15. 将凝胶转移到装有 200 mL 考马斯蓝染色溶液的小盒子中，并在室温下在摇杆上保持1小时。从染色溶液中取出凝胶并用 5 – 10 mL 水洗涤 3 次。将洗涤后的凝胶转移到 200 mL 的脱色溶液中，并在室温下保持在摇杆上1 小时。如果条带不可见，则添加新鲜的脱色溶液，并再次孵育凝胶直至条带可见。比较诱导和非诱导泳道之间感兴趣的条带的强度。诱导和未诱导样品之间的明显差异将有助于识别诱导后表现出最佳表达的菌落。例如，在图 1A 中诱导和未诱导细胞之间的 N 蛋白条带强度存在明显差异（将诱导车道 2 和 3 与图 1A 中相应的未诱导车道 9 和 10 进行比较）。 S选择最佳表达菌落进行大规模表达。
16. 一旦确定了表达最高量蛋白质的菌落，从该菌落中取出 1 mL 的原代培养物，在步骤 9 中保存，并将其添加到 500 mL 含有卡那霉素（50 μg/mL）的 LB 培养基中。从早上开始这一步。
17. 步骤 10 所述，在 37°C 下摇动培养所得培养物，定期测量 600 nm 培养溶液的 OD 。
18. 当 600 nm 的 OD 达到 0.3 – 0.5 时，加入 500 μL 的 IPTG 储备溶液 (1,000 × )，然后在 16 °C 下持续摇动孵育过夜，如步骤 12 所述。
19. 第二天早上，将 500 mL 的过夜培养物分成 5 个试管，并通过4,000 × g离心20分钟将每个试管沉淀下来。弃去上清液，保留沉淀用于下一步蛋白纯化。或者，颗粒可以储存在-80°C 以备后用。

C. 使用 AKTA 纯机器纯化 CCHF-NP。
20. 将来自步骤 19 的单管中的颗粒重新悬浮在 20 mL 的裂解缓冲液中。对裂解液进行六次超声处理，每次 30 秒，在超声处理步骤之间将样品在冰上放置 60 秒。声波处理强度级别设置为超声波仪上的超声波频率 -40 kHz (>400W) 。然而，任何其他超声波频率 > 20 kHz 的超声波仪都可用于细胞裂解物的超声波处理。
21. 超声处理后培养物应该变得明显更清晰，但仍会有些不透明。如果裂解物不清楚，您可以在 4 的强度水平下再超声处理 30 秒，将溶液放在冰上 1 分钟。
22. × g将裂解物离心20 分钟，以沉淀细胞碎片。将颗粒储存在 -80°C 以备后用，以确认大量蛋白质溶解到上清液中。上清液将用于下面的步骤 23。在后面的步骤中为 SDS-PAGE 保留 100 μL 的上清液。
23. 在两个单独的烧杯中制备 500 mL 的每个裂解缓冲液和洗脱缓冲液，分别标记为烧杯 A 和烧杯 B。将步骤 22 中的上清液加载到 AKTA Pure HPLC 蛋白质纯化系统的超级循环中，并以每分钟 20 mL 的全速以相等的比例加载总共 20 mL 的裂解和洗脱缓冲液。这将清洁 AKTA Pure 系统的泵和管道，默认情况下流出物将被浪费。
24. 将 HisTrap 柱连接到 AKTA Pure 蛋白质纯化系统。使用 Unicorn 7.0 软件，以每分钟 4.0 mL 的速度运行至少 10 个柱体积，使柱与裂解缓冲液平衡。确保色谱柱上的压力不超过 0.5 Mpa。
25. 在色谱柱平衡的同时，在 Unicorn 7.0 软件上准备运行程序，如下所示：
a. 用 5 柱体积 (5 CV) 的裂解缓冲液清洗柱子。
b. 将 UV 监视器重置为零。
c. 以 1 mL/min 的速度将样品添加到色谱柱中。收集流出物。
d. 用 5 CV 的裂解缓冲液清洗柱子。使用馏分收集器收集洗涤液。
e. 在 20 CV 上运行从 0% 洗脱缓冲液到 100% 洗脱缓冲液的洗脱梯度。使用馏分收集器收集馏分。
f. 用 10 CV 的洗脱缓冲液清洗色谱柱。让洗涤物浪费掉。
g. 用 10 CV 的水清洗色谱柱。如需长期储存，请使用 20% 乙醇水溶液。
26. 运行完成后开始运行并从馏分收集器中取出样品。如果您的蛋白质具有较高的聚集趋势，您可能会在此阶段看到溶液变浑浊。在这种情况下，请快速执行下面的步骤 27 和 28。
27. 使用 AKTA 纯化器上保存的洗脱配置文件来识别包含洗脱蛋白质的级分。如图 1B 所示，CCHFVNP 从分数 1 开始洗脱，并在分数 7 中达到峰值。在 -80 °C 下从每个洗脱中保存 100 μL 的样品，用于 SDS-PAGE 分析，以确认洗脱分数中蛋白质的存在。
28. 将等体积的稀释缓冲液添加到每个洗脱部分。轻轻混合溶液，并在-80°C 下将管子直立冷冻过夜。

图1。使用去污剂梯度方法纯化 CCHFV 核衣壳蛋白。
( A )考马斯染色的12% SDS-PAGE凝胶，显示了Rosetta DE3大肠杆菌细胞不同菌落中CCHFV NP的表达。未诱导的菌落 1 和 2 显示为对照。 ( B ) AKTA 纯蛋白纯化系统中 CCHFVNP 的洗脱曲线。（ C ）考马斯染色的 10% SDS-PAGE 凝胶，显示了 AKTA 纯的代表性洗脱部分中的 CCHFVNP。 ( D ) 将含有总共 10 mL 溶液的稀释级分在室温下解冻，在 -80 °C下冷冻过夜后。线上的数字显示试管上的 1-mL 标记。将 10 mL 管中的 1 mL 馏分倒入 1.5 mL-Eppendorf 管中，而不会干扰浓度梯度，如图所示。 1.5-mL 级分的 SDS-PAGE 分析显示每个级分中存在 CCHFVNP。 ( E ) 馏分 1、4、10 和D 组中的馏分 1-4 的混合物使用BLI 测定 RNA 结合活性。 ( F ) 使用 BLI 对 CCHFVNP 进行 RNA 结合分析。应该注意的是，F 组中使用的 CCHFVNP 没有通过 D 组所示的洗涤剂梯度纯化。没有观察到 RNA 结合活性。该数据已发表在我们最近的手稿中（ Royster等人，2021 年）。

29. 第二天早上，在 12% SDS-PAGE 凝胶上运行步骤 27 中保存的级分，以识别不含任何污染细菌蛋白的纯蛋白质浓度最高的级分。用考马斯蓝染色凝胶，然后脱色，如步骤 13 和 14 中所述。如图 1C 所示，所有洗脱组分中都存在无污染的 CCHFVNP。然而，在馏分 6 – 8中浓度最高。某些洗脱液可能仍含有污染的细菌蛋白质——应避免使用这些馏分。
30. 可选：从原始裂解液（步骤 22）、流穿液（步骤 25c）和沉淀（步骤 22）运行样品有助于确定蛋白质是否可溶于裂解液中，以及可溶性蛋白质是否可以有效地结合柱子。如图 1C 所示，CCHFVNP 可溶于裂解缓冲液中，但大量蛋白质仍保留在颗粒中。蛋白质与色谱柱紧密结合，因为流穿液中存在少量蛋白质。
31. 一旦在步骤 29 中鉴定出含有高浓度无污染蛋白质的级分，从 -80 °C冰箱中取出相应的稀释级分（从步骤 28 开始）。例如，如图 1C 所示，CCHFVNP 的最高浓度存在于馏分 6-8 中，因此稀释的馏分 7 从 -80 °C冰箱中取出。让级分在室温下不受干扰地直立解冻。当溶液解冻时，形成洗涤剂梯度，管底部的洗涤剂浓度高，管顶部的洗涤剂浓度低。错误折叠的蛋白质向高浓度去污剂迁移，向试管底部迁移。正确折叠的蛋白质保持在低浓度区，朝向梯度顶部。切勿打扰解冻的试管，因为它会干扰梯度形成。
32. 小心地从解冻管顶部取出 1 mL馏分，轻轻吸气，避免将气泡排入管中。将吸入的 1 mL 馏分倒入 1.5 mL Eppendorf 管中，如图 1D 所示。顶部馏分将包含正确折叠的蛋白质，而错误折叠的蛋白质将存在于底部馏分中。使用Bradford 蛋白检测试剂盒对每个馏分中的蛋白进行定量。蛋白质部分可以储存在-80°C 的冰箱中。可以将含有活性蛋白质的级分合并在一起以供长期使用。对于我们的蛋白质 (CCHFNP)，几乎 60% 被聚合，剩下的 40% 是活跃的。

D. 使用生物层干涉法 (BLI) 测试去污剂梯度组分中蛋白质的 RNA 结合活性。
33. 将 5 μL的生物素化 RNA（1.2 μg / μL ）添加到 300 μL的 RNA 结合缓冲液中，并将所得混合物保存在冰上的黑色 0.5 mL Eppendorf 管中。
34. BlitzPro 1.2 软件对 BLITZ PROBE (ForteBio) 机器进行编程。
a. 使用 RNA 结合缓冲液选择初始洗涤步骤 30 秒。
b. 选择生物素化 RNA 与生物传感器的结合 200 秒。
c. 使用 RNA 结合缓冲液选择第二个洗涤步骤 30 秒。
d. 选择蛋白质与生物素化 RNA 的关联 300 秒。
e. 选择蛋白质与 RNA 的分离 500 秒。
35. 高精度链霉亲和素生物传感器水合至少 10 分钟。将水合探针装入 BLITZ 机器。
36. 在 0.5 毫升黑管内的 RNA 结合缓冲液中以所需浓度稀释第 1 部分的蛋白质。保持 RNA 结合缓冲液为洗涤步骤做好准备。之前不要稀释蛋白质，以避免潜在的聚集。开始运行。该软件将引导您按照步骤 34 中的说明进行操作。随着绑定周期的运行，绑定数据由内置软件连续绘制，如图 1E 所示。第一个循环完成后，以不同浓度的相同蛋白质部分开始另一个循环，但保持 RNA 的浓度相同（1.2 µg / µL ）。
37. 一旦获得每个馏分的两个或多个浓度的动力学曲线，通过 BlitzPro 1.2 软件分析动力学数据，以计算开启速率和关闭速率常数，然后由软件用于计算解离量化蛋白质-RNA相互作用的结合亲和力的常数（K d ）。
38. 检查洗涤剂梯度的所有其他部分，以确定含有活性蛋白的部分，如图 1E 中的代表性曲线所示。我们绘制了 CCHFVNP 在通过洗涤剂梯度法纯化之前的结合曲线，以证明它没有显示活性（图 1F）。

数据分析

在固定浓度的 RNA 和两种或多种蛋白质浓度下生成蛋白质-RNA 相互作用的动力学曲线，也称为传感图，如图 1E 所示。然后通过内置的Blitz Pro 1.2 软件在全局模式下分析动力学曲线，其中软件处理不同浓度的所有传感图以生成开启速率常数 (K ass ) 和关闭速率常数 ( K离散)。然后软件使用这些常数来计算解离常数 (K d )。请注意， K d = K ass /K dis 。然后，Blitz Pro1.2 软件在本地模式下单独分析传感图，以计算每个传感图的这些参数。如果在三种不同浓度的蛋白质下进行实验，那么三个传感图会产生三个 K d值，用于计算标准偏差（SD），如下图所示。

表 1. 野生型 N 蛋白及其茎结构域与 S 段衍生 mRNA 的 5' UTR 关联的结合参数
蛋白质名称 K d ( nM ) K屁股( m -1 s -1 ) K dis ( s -1 )
茎部分 1 54.24±10 1.08 × 10 5 5.87 × 10 -3
茎部分 4 52.48 ± 16 3.11 × 10 5 1.82 × 10 -2
秸秆混合物 1-4 36.67 ± 3 1.40 × 10 5 5.10 × 10 -3

食谱

1. 1,000 ×卡那霉素原液
试剂最终浓度数量
卡那霉素 50 毫克/毫升 0.5克
H 2 O 不适用 10 毫升
全部的不适用 10 毫升
在将抗生素添加到 LB 琼脂之前，首先对 LB 溶液进行高压灭菌，然后在添加抗生素之前让它们冷却到 ~ 40°C。

2. 1,000 × IPTG 库存
试剂最终浓度数量
IPTG 0.5M 1.2克
H 2 O 不适用 10 毫升
全部的不适用 10 毫升

3. 裂解缓冲液
试剂最终浓度数量
氯化钠 150 毫米 17.5 克
Tris-HCl (pH 7.4) 50毫米 12 克
海卫 X-100 1% 20 毫升
H 2 O 不适用 1,980 毫升
全部的不适用 2,000 毫升
2+色谱柱保持理想的结合效率，该缓冲液的 pH 值应为 7.2 – 8.0。

4. 洗脱缓冲液
试剂最终浓度数量
氯化钠 500 毫米 29 克
Tris-HCl (pH 7.0) 50毫米 6克
咪唑 250 毫米 17克
海卫 X-100 1% 10 毫升
H 2 O 不适用 990 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

5. LB肉汤
试剂最终浓度数量
LB米勒肉汤 2.5% 25 克
H 2 O 不适用 1升
全部的不适用 1升
混合后立即高压灭菌，并在添加任何抗生素之前让其冷却至接触。

6. LB 琼脂板
试剂最终浓度数量
LB米勒琼脂 4% 40 克
H 2 O 不适用 1升
全部的不适用 1升
混合后立即高压灭菌，并在添加任何抗生素之前让其冷却至接触。当琼脂约为 60°C 时加入抗生素，然后立即混合并倒入。

7. 5 × SDS 上样染料
试剂最终浓度数量
Tris-HCl 250 毫米 4.4 克
安全数据表 10% 30 克
甘油 30% 90 毫升
B-巯基乙醇 5% 15 毫升
溴酚蓝 0.02% 60 毫克
H 2 O 不适用 195 毫升
全部的不适用 300 毫升
β-巯基乙醇应添加到等分试样的 SDS 染料中，因为它在室温下不稳定。

8. SDS-PAGE
试剂 5% 浓缩凝胶溶解凝胶 12%
超纯 H 2 O 4.0 毫升 3.3 毫升
30% 双丙烯酰胺 1.0 毫升 4.0 毫升
1 M Tris-HCl，pH 6.8 0.75 毫升不适用
1.5 M Tris-HCl，pH 8.8 不适用 2.5 毫升
10% SDS 60 µL 100 µL
10% APS 60 µL 100 µL
TEMED
总容积 8 µL
6 毫升 8 µL
10 毫升
给定的体积足以在 1.00 mm 板上制作两块凝胶。先制作并倒入分离凝胶。在分离凝胶上加入 1 mL 乙醇或异丙醇。 15-20 分钟后，当分离胶凝固后，倒出密封液。将浓缩胶直接倒在分离胶上，然后插入梳子。

9. 考马斯蓝染色液
试剂最终浓度数量
甲醇 50% 250 毫升
冰醋酸 10% 50 毫升
考马斯蓝 0.125% 0.625 克
H 2 O 不适用 200 毫升
全部的不适用 500 毫升

10. 考马斯蓝脱色液
试剂最终浓度数量
甲醇 40% 200 毫升
冰醋酸 10% 50 毫升
H 2 O 不适用 250 毫升
全部的不适用 500 毫升

11. 生物素化 RNA
对应于病毒 S 段基因组 RNA 的 5' 末端的 40 个核苷酸长的 RNA，由 Genscript 合成并在 3' 处用生物素标记。或者，可以使用 T7 RNA 聚合酶试剂盒合成 RNA，并用 CTP 进行生物素化。 RNA 以 1.2 μg / μL的浓度溶解在无 RNase 的水中，并以 5 μL的等分试样储存在 -80 °C冰箱内。

12. 稀释缓冲液
试剂最终浓度数量
Tris-HCl (pH 7.4) 50毫米 6克
L-精氨酸 2毫米 0.35 克
L-谷氨酰胺 2毫米 0.30 克
海卫 X-100 1% 10 毫升
吐温 20 0.4% 4 毫升
H 2 O 不适用 986 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

13. RNA 结合缓冲液
试剂最终浓度数量
氯化钠 80 毫米 2.3 克
HEPES (pH 7.4) 40毫米 13.8 G
氯化钾 20毫米 0.8 克
数字地面电视 1毫米 0.08 克
H 2 O 不适用 500 毫升
全部的不适用 500 毫升

致谢

我们要感谢 Mohammad Mir 博士审查该协议。该协议中报告的数据（图 1）之前已发布（ Royster等人，2021 年）。

利益争夺

作者没有任何财务或非财务竞争利益。

参考

1. Carrio, MM 和 Villaverde, A. (2005)。分子伴侣 DnaK 和 GroEL 在细菌包涵体中的定位。 J细菌187（10）：3599-3601。
2. Chrunyk, BA, Evans, J., Lillquist, J., Young, P. 和 Wetzel, R. (1993)。白细胞介素 1 β 序列变体中的包涵体形成和蛋白质稳定性。生物化学杂志 268（24）：18053-18061 。
3. Freedman, RB 和 Wetzel, R. (1992)。蛋白质工程。 Curr Opin Biotechnol 3（4）：323-325。
4. Royster, A., Mir, S. 和 Mir, MA (2021)。一种纯化易聚集蛋白的新方法。公共科学图书馆一号16（11）：e0260143。
5. Wang, W. 和 Roberts, CJ (2018)。蛋白质聚集 - 机制、检测和控制。国际药学杂志 550（1-2）：251-268。
6. Williams, DC, Van Frank, RM, Muth, WL 和 Burnett, JP (1982)。大肠杆菌中的细胞质包涵体产生生物合成人胰岛素蛋白。科学215（4533）：687-689。