材料和试剂

A.用于 gDNA 分离
1.过滤器 MAXIPENSE TM ，低保留，透明，无菌吸头 1,000 μL （ Tarsons ，目录号：527106 ），200 μL （ Tarsons ，目录号：527104 ）和 10 μL （ Tarsons ，目录号：527100 ）
2.Spinwin TM Micro Centrifuge 透明无菌管 1.5 mL（ Tarsons ，目录号：500010 ）和 2 mL（ Tarsons ，目录号：500020 ）
3.解剖盒
4.抹刀
5.卫生纸
6.金维普斯
7.无核酸酶水（Promega，目录号：P1193 ）
8.1 ×无菌PBS（ HiMedia ，目录号：TL1022 ）
9.苯酚-氯仿-异戊醇（24：24：1）（Sigma-Aldrich，目录号：516276 ）
10.冰冷的无水乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459836 ）
11.RNase A（Sigma-Aldrich，目录号：R6513 ）
12.三碱基
13.盐酸
14.乙二胺四乙酸
15.氯化钠
16.安全数据表
17.Milli-Q ®超纯水
18.70% 乙醇 (1,000 mL)（参见食谱）
19.裂解缓冲液 (100 mL)，pH 7.2（参见配方）

B.用于组织 RNA 分离
1.过滤器 MAXIPENSE TM ，低保留，透明，无菌吸头 1,000 μL （ Tarsons ，目录号：527106 ），200 μL （ Tarsons ，目录号：527104 ）和 10 μL （ Tarsons ，目录号：527100 ）
2.Spinwin TM Micro Centrifuge 透明无菌管 1.5 mL（ Tarsons ，目录号：500010 ）和 2 mL（ Tarsons ，目录号：500020 ）
3.解剖盒
4.1毫升注射器
5.称重纸（Fisher Brand，尺寸 4" × 4"）
6.卫生纸
7.金维普斯
8.研钵和研杵
9.RNA later® （Sigma-Aldrich，目录号： R0901 ）
10.核糖核酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：R2020 ）
11.无核酸酶水（Promega，目录号：P1193 ）
12.液氮
13.RNeasy Mini Kit（Qiagen，目录号：74104 ）
14.DNase I（Qiagen，目录号：74106 ）
15.RDD缓冲区（Qiagen，目录号：74106 ）
16.70% 乙醇 (1,000 mL)（参见食谱）

设备

1.移液器（1,000 μL 、200 μL 、20 μL 、2 μL ）（Thermo Fisher，马萨诸塞州，美国）
2.-80 °C 冰箱（Thermo Fisher，马萨诸塞州，美国）
3.CO 2室（Thermo Fisher，马萨诸塞州，美国）
4.Vortex (Fisher Biotec , Wembley WA 6904, Australia)
5.微量离心机（Eppendorf，汉堡，德国）
6.层流 (Thermo Fisher Scientific, Columbus, OH, USA)
7.Thermoshaker （Thermo Fisher，马萨诸塞州，美国）
8.Rotospin ( Tarsons , Kolkata, India) 或任何试管旋转器
9.Nanodrop 2000 机器（Thermo Fisher Scientific，Columbus，OH，USA）或任何 UV-VIS 分光光度计（最小样品体积0–5 μL ）
10.Qubit4 荧光计（Invitrogen，California，USA）或任何普通荧光计
11.水平凝胶电泳仪（美国加利福尼亚州）

程序

第一部分：从小鼠盲肠内容物中分离微生物 gDNA

A.盲肠内容物的收集
1.无菌解剖鼠标并小心取出盲肠。
2.在层流气流内的无菌 2 mL 微量离心机中收集盲肠内容物，以避免任何类型的环境污染。正确标记样品。立即快速冷冻盲肠内容物并将其储存在 -80 °C 以供进一步使用（图形摘要步骤 1 ）。

图形摘要步骤 1.盲肠内容物的收集。

B.盲肠 DNA 提取
1.从 -80 °C 冰箱中取出 cecal 样品并将其放在冰上。将 180–220 毫克的盲肠内容物无菌转移到无菌的 2 mL 微量离心管中。
2.将 1 mL 1 ×无菌冰冷 PBS 添加到样品中，并通过剧烈涡旋和移液使其适当均质化。
3.以 1,500 × g离心悬浮液在室温下 5 分钟（图形抽象步骤 2 )。

图形摘要步骤 2。盲肠样品的离心。

4.小心去除上清液。向颗粒中加入 600 μL裂解缓冲液并通过移液器适当混合（图形摘要步骤 3 ）。
注意：不要使用涡旋混合。

图形抽象步骤 3 。裂解缓冲液添加。

5.微量离心管倒置数次，将混合物在70°C 下保持 30 分钟并间歇混合（图形抽象步骤 4 ）。

图形抽象步骤 4。在 70 °C 下加热。

6.在 15,700 下离心裂解物 × g在 4 °C 下 15 分钟，然后将上清液收集在无菌 2 mL 微量离心管中。
7.将 1 mL 的苯酚-氯仿-异戊醇 (24:24:1) 添加到裂解液中，将管子颠倒大约 12-15次，适当混合2-3 分钟。
8.在 15,700离心混合物 × g在 4 °C 下 15 分钟。
9.在新的无菌 2 mL 微量离心管中收集上层水相。重复步骤 7-9 至少两次，直到裂解液无色。
10.向无色裂解液中加入三倍体积的冰冷无水乙醇，同时在rotospin仪器中反转和旋转 5-10 分钟，轻轻混合。
11.将溶液在 -80°C 下冷冻至少 1 小时。为了更好地沉淀 DNA，请将其在冰箱中保存 4-5 小时（图形摘要步骤5 ）。

图形抽象步骤5。-80 °C 下的沉淀。

12.通过在 15,700 下离心分离沉淀物 × 克在 4 °C 下 15 分钟。
13.μ L的 70% 乙醇洗涤沉淀一次，并在 15,700 下离心 × g在 4 °C 下 15 分钟（图形抽象步骤 6 ）。

图形抽象步骤 6。乙醇洗涤。

14.在室温下干燥颗粒 20-30 分钟。
15.加入 50–100 μL无核酸酶的水，轻轻敲击混合。
16.加入 5 μL RNase A 并在室温下保持 15 分钟。
17.重复步骤 10-15 以去除 RNase A 并恢复纯微生物 gDNA（图形摘要步骤7 ）。

图形摘要步骤7。微生物 gDNA。

18.RNA的质量和数量，并将其储存在 -80°C 的冰箱中。

第二部分：从小鼠结肠组织中提取 RNA

A.结肠组织样本的收集
1.无菌解剖小鼠并从整个肠道切下结肠部分。
2.×无菌 PBS冲洗去除结肠内容物。
3.将组织 (80–120 mg) 切成小块, 并将其储存在RNALater (1,800 μL ) 中, 在 -20 °C 冰箱中供进一步使用。

B.RNA提取
对于结肠组织的 RNA 分离，我们使用 Qiagen RNeasy 迷你试剂盒，并额外使用液氮搅拌组织以获得更好的产量。
1.重量 20-30 毫克（不超过 30 毫克）的结肠组织。使用Kimwipes从组织样本中去除剩余的 RNALater。
2.将组织样本放入研钵中。加入充足的液氮并立即用杵搅拌组织。确保所有液氮在研磨前蒸发（图形摘要步骤8）。
注意：在第 2 步之后，按照 Qiagen RNeasy Mini Kit 协议进行操作。

图形抽象步骤 8。组织研磨。

3.将 700 μL的 RLT 缓冲液添加到砂浆中，并通过移液将搅拌过的组织与缓冲液混合。
4.将裂解物转移到 1.5 mL 无菌微量离心管中，并在 14,000 下离心 × g在室温下保持 3 分钟。
5.通过移液小心地去除上清液，并将 1 体积的 70% 乙醇添加到裂解液中。通过移液器和离心机在 14,000下充分混合 × g在室温下保持 3 分钟。
6.小心地去除上清液并将多达700 μL的样品转移到放置在 2 mL 收集管中的RNeasy Mini 离心柱中。
7.盖上盖子并在 8,000 下离心 × g在室温下保持 15 秒。离心后，丢弃流出液。
8.加入 350 μL Buffer RW1，盖上盖子，在 8,000 下离心 × g在室温下保持 15 秒。离心后，丢弃流出液。
9.将 10 μL的 DNase I 储备溶液添加到 70 μL的 Buffer RDD 中，并通过轻轻倒置试管进行混合。做一个简短的旋转。
10.将 80 μL DNase I 孵育混合物直接添加到 RNeasy 柱膜中，并在室温下保持 15 分钟（图形摘要步骤9 ）。

图形摘要步骤 9。柱纯化。

11.将 350 μL缓冲液 RW1 添加到 RNeasy 旋转柱中。盖上盖子并在 8,000 下离心 × g在室温下保持 15 秒。丢弃流过。
12.将 500 μL缓冲 RPE 添加到 RNeasy 旋转柱中。盖上盖子并在 8,000 下离心 × g在室温下保持 15 秒。丢弃流过。
13.将 500 μL缓冲 RPE 添加到 RNeasy 旋转柱中。盖上盖子并在 8,000 下离心 × g在室温下 2 分钟。丢弃流过。
14.将 RNeasy 旋转柱放入新的 2 mL 收集管中。全速离心 1 分钟以干燥膜。
15.将 RNeasy 旋转柱放入新的 1.5 mL 收集管中。
16.将 30–50 μL的无核酸酶水直接添加到自旋柱膜中。等待 2 分钟。
17.盖上盖子并在室温下以8,000 × g离心 1 分钟以洗脱 RNA。
18.立即检查质量和数量，并将RNA 储存在 -80°C 冰箱中（图形摘要步骤 10 )。

图形抽象步骤 10. 组织 RNA。

数据分析

NanoDrop分析（图形摘要步骤）可以测量获得的 DNA（近似预期产量/浓度：800 – 2,200 ng/ μL ）和 RNA（近似预期产量/浓度：700 –2,000 ng/ μL ）的浓度和质量 11 )。可以测定 260 nm/230 nm 和 260 nm/280 nm 处的吸光度比，分别评估提取的 DNA 和 RNA 的纯度。可以通过 Qubit 荧光计验证 DNA 和 RNA 浓度（图形摘要步骤 12 )。 DNA 和 RNA 的完整性可以分别通过 0.8% 和 2% 的琼脂糖凝胶电泳进行评估。

图形抽象步骤11. Nanodrop 的数量检查。

图形摘要步骤12。琼脂糖凝胶质量检查。

笔记

1.重要的是在一天中的同一时间从实验队列中的所有动物身上采集盲肠样本，以避免肠道微生物群的昼夜波动（ Thaiss 等。 , 2014)。还建议同时从单个队列的新鲜收集样本中分离 DNA 以避免储存伪影，因为已证明盲肠样本的冷冻会影响厚壁菌门与拟杆菌门的比例（ Bahl 等。 , 2012) 。

食谱

1.用于 gDNA 分离的裂解缓冲液 (100 mL)，pH 7.2
试剂最终浓度数量
三碱基不适用1.211 克
盐酸0.1M8.940 毫升
乙二胺四乙酸20毫米0.744 克
氯化钠100毫米0.584 克
安全数据表4%4.000 克
Milli-Q ®超纯水100 毫升用水调节音量

2.70% 乙醇 (1,000 毫升)
试剂最终浓度数量
乙醇（绝对）70%700 毫升
Milli-Q ®超纯水不适用300 毫升

致谢

我们感谢Biswaranjan Pradhan 博士帮助我们标准化 DNA 分离方案。
等人在我们实验室的前两份报告。（2019 年和 2022 年），我们从中采用了上述 DNA 分离方案。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

动物实验控制和监督委员会，政府。印度 (CPCSEA) 批准了这项研究（IAEC，Reg. No-1634/GO/ ReBi /S/12/CPCSEA，协议号 NISER/SBS/IAEC/AH-186）。所有实验均按照批准的指南进行。

参考

1.Bag, S., Saha , B., Mehta, O., Anbumani , D., Kumar, N., Dayal , M., Pant, A., Kumar, P., Saxena, S., Allin , KH等人. （2016 年）。从人类和环境样本中提取高质量宏基因组 DNA 的改进方法。科学代表6：26775。
2.Bahl , MI, Bergstrom, A. 和 Licht, TR (2012)。在 DNA 提取之前冷冻粪便样本会影响通过下游定量 PCR 分析确定的厚壁菌门与拟杆菌门的比率。 FEMS 微生物快报329（2）：193-197。
3.Brooks, JP, Edwards, DJ, Harwich, MD, Jr., Rivera, MC, Fettweis , JM, Serrano, MG, Reris , RA, Sheth , NU, Huang, B., Girerd , P.等。（2015 年）。宏基因组学的真相：量化和抵消 16S rRNA 研究中的偏差。 BMC 微生物15：66。
4.Ferrand, J.、Patron, K.、Legrand- Frossi , C.、 Frippiat , JP、Merlin, C.、 Alauzet , C. 和Lozniewski , A. (2014)。从小鼠粪便和盲肠样本中提取细菌 DNA 的七种方法的比较。 J 微生物方法105：180-185。
5.Gryp , T., Glorieux, G., Joossens , M., Vaneechoutte , M. (2020)。从人类粪便样本中的细菌细胞中提取 DNA 的五种检测方法的比较。应用微生物学杂志 129(2)：378-388。
6.Pradhan, B., Guha, D., Naik, AK, Banerjee, Tambat , S., Chawla, S., Senapati, S., Aich , P. (2019)。益生菌L. acidophilus和B. clausii调节 Th1 和 Th2 偏向小鼠的肠道微生物群，以改善鼠伤寒沙门氏菌引起的腹泻。益生菌抗菌蛋白11：887-904。
7.Pradhan, S.、Ray, P. 和Aich , P. (2022)。从年轻小鼠到年老小鼠的微生物群移植可以恢复失去的免疫力，从而有效清除偏向 Th2 的 BALB/c 小鼠的沙门氏菌感染。生命科学288：120201。
8.Thaiss , CA, Zeevi , D., Levy, M., Zilberman - Schapira , G., Suez, J., Tengeler , AC, Abramson, L., Katz, MN, Korem , T., Zmora , N., et人_ （2014）。微生物群昼夜振荡的跨界控制促进代谢稳态。单元格159（3）：514-529。
9.Videnska , P., Smerkova , K., Zwinsova , B., Popovici , V., Micenkova , L., Sedlar 。 K., Budinska , E. (2019) 。使用 MiSeq Illumina 平台进行 16S rRNA 基因测序后，粪便采样和 DNA 分离试剂盒会影响 DNA 质量和细菌组成。科学代表9 ： 13837。