材料和试剂

材料
锥形管，50 mL（Biologix，目录号： 10-9502）
带螺旋盖的聚丙烯离心瓶，250 mL（Beckman Coulter，目录号：356011）
带有螺旋盖的聚丙烯离心瓶，50 mL（Beckman Coulter，目录号：357003）
金属刮刀
直径0.5毫米的玻璃珠（Millipore Sigma，Sigma，目录号：G8772）
玻璃管（ Kimax ，目录号：45048）
玻璃滴管
色谱纸 (Sartorius Stedim FN3 580 × 600 mm)
闪烁20 mL玻璃计数瓶（Wheaton，目录号：986532）

试剂
酵母提取物（ Bacto TM ，目录号：212750），室温（RT）储存
腺嘌呤（Millipore Sigma，Sigma，目录号：A8626），储存于 RT
酵母氮碱（YNB）（ Thermo Fisher Scientific，BD Difco ，目录号：DF0392-15-9），储存于室温
嘌呤霉素10 mg/mL（ InvivoGen ，目录号：ant-pr-1），4°C储存
放线菌酮2 mg / mL（Millipore Sigma，目录号：C-6255），储存在-20°C
D-[ 14 C(U)]- Glc （Perkin Elmer，目录号：NEC042V20UC），4℃保存
葡萄糖1 M（Dextrose 1-hydrate， Biopack ，目录号：9812.08），储存于室温
甲醇 99.9%（Millipore Sigma，Merck，目录号：106009），储存于 RT
氯仿（Merck，目录号：107024），储存于 RT
1-丙醇 98%（Millipore Sigma，Merk，目录号：100997），储存于 RT
硝基甲烷（Millipore Sigma，目录号：270423），储存于 RT
用于分析的盐酸发烟37％（Merck，目录号：1003171000）
PPO-POPOP闪烁鸡尾酒（浓缩闪烁体PPO-POPOP，RPI，目录号：111045）
Milli Q水
添加腺嘌呤 (YEA) 的酵母提取物培养基（参见食谱）
不含葡萄糖的酵母氮碱 (YNB)（参见食谱）
用于标记 500 μL样品的放射性溶液（参见配方）
氯仿：甲醇：水（1：1：0.3）（见食谱）
氯仿：甲醇：水（1:16:16）（见食谱）
0.02 N HCl（见配方）

设备

1升玻璃烧瓶
轨道摇床（用于烧瓶）设置为28 °C （ Forma Scientific，型号：4581）
OD 600阅读器（Amersham Biosciences，型号：Ultraspec 10）
离心机 (Beckman Avanti) 带有旋翼 JA-14 和 JA-20
Thermomixer 设置为28 °C ( Thermo-shaker, mrc )
水浴( Vicking SRL )
气流（水族气泵RS-Electric，型号：RS-15000）
模拟台式离心机（ Rolco ）
Vortex（ Scientific Industries，型号：Vortex-genie 2 ）
冰柜-20 ° C (肯特)
玻璃层析室（自制）
闪烁计数器 (Pharmacia, RackBeta 1214/1219)
注：此处描述的设备可以很容易地替换为其他品牌的普通实验室设备。

软件

Microsoft Excel （2016 版）（Microsoft.com ）

程序

体内标记
收获S. pombe细胞（4 小时）
接种含有 5 mL 无菌 YEA 培养基的 50 mL Falcon 管，并带有所需的S. pombe菌株的分离菌落。在 28°C 和 250 rpm 的轨道摇床上过夜生长。
第二天早上在 1 L玻璃烧瓶中接种 250 mL 无菌 YEA 用 1 mL 的过夜S. pombe文化。
在 28 °C 下生长和250 rpm 直到达到指数生长期 (OD = 1 – 1.5)。时间可能因应变而异。
在 250 mL 离心瓶中以 3,000 × g和 4 °C离心200 mL 培养物5 分钟。
弃去上清液。
将颗粒重新悬浮在 30 mL 的冷 1% YNB 中。在此步骤中，可以先使用 10 mL 玻璃移液器和移液器 a id将细胞重新悬浮在 10 mL 冰冷的 YNB 中，然后加入剩余的 20 mL。
将 30 mL 样品转移到先前称重的 50 mL 离心瓶管中。把它放在冰上。称重管子对于计算细胞的湿质量很重要。
在 3,000 × g和4 °C 下离心 5 分钟，弃去上清液。
如步骤 A6 所述，将颗粒重新悬浮在 30 mL 的 YNB 中，并如步骤 A8 中所述将离心机重悬。
弃去上清液。将管面朝下放在纸巾上，除去剩余的液滴。
- A10再次用 YNB 清洗颗粒。
用颗粒称重管子，并通过减去每个空管的重量来计算细胞的湿质量。每克细胞 (v/w)添加两卷冷 YNB。如果您有0.5 g 湿重，则应添加 1 mL 培养基。用移液器重悬细胞。
悬液中取出 500 μL ，将其放入新的 50 mL 离心瓶中，进行标记。

准备放射性脉冲试剂（15 – 30 分钟）
在化学罩内的玻璃管中，每个样品加入 200 μ Ci [ 14 C]-葡萄糖，并在室温下暴露于恒定气流中干燥。按照批准的程序在您的机构中操作放射性液体。
干燥后，将放射性物质溶解在含有 50 mM Glc的 50 μ L YNB 中（参见配方 3）。

酵母细胞标记（20 分钟）
将蛋白质合成抑制剂嘌呤霉素和放线菌素添加到步骤 A13 的 500 μL细胞悬浮液中，分别达到 50 μg /mL 和 70 μg /mL 的最终浓度。在 28°C 下孵育管 2 分钟。
将整个放射性溶液添加到细胞悬液中。使用热混合器在 28°C下以 200 rpm 的速度孵育样品 15 分钟。
通过将所有细胞转移到含有5 mL 甲醇的玻璃管中来停止脉冲。

提取 LLO
笔记：
如果协议在第 19 步中断，则此步骤在第一天需要 6 小时，第二天需要 4 小时；或者，如果完全在同一天执行，则为 10 小时。
LLO 的提取遵循以下基本原理：这些化合物具有大的亲水和疏水部分。因此，它们不溶于氯仿:甲醇(3:2) 等溶剂，其亲水性差但能够溶解磷脂，或者不溶于疏水性差但能够溶解水溶性代谢物的甲醇或水中。相反，氯仿:甲醇:水(1:1:0.3) 是一种单相溶剂，具有亲水性和疏水性，因此能够提取多醇连接的寡糖。

将玻璃管在室温下以 2,000 × g离心 3 分钟，然后小心弃去上清液。
笔记：
程序 D 的所有以下离心步骤应在相同条件下进行。
遵循机构规则丢弃放射性物质。
加入 5 mL氯仿:甲醇(3:2) 并通过涡旋完全重悬沉淀。这种颗粒特别难以重悬。为此，在涡旋时在试管中放置一把小抹刀很方便。在样品摇动期间，刮刀必须主动保持在试管内。重新悬浮颗粒后，从管中取出抹刀，将其放在盛有水的大烧杯中，直到下次使用。
重复步骤 D1 – D2 两次，用氯仿：甲醇(3:2)完成三次萃取。
加入 5 mL 甲醇并重悬沉淀，如步骤 D2 中所述。
离心并弃去上清液。
涡旋重悬沉淀，使用刮刀帮助。
离心并弃去上清液。
在 2 mL 的冰冷水中和 0.5–1 mL 的玻璃珠中重新悬浮细胞。
涡旋样品 10 分钟。每 1 分钟停止一次涡旋，将样品放在冰上 1 分钟，从而避免过热。
离心机。
添加 Milli Q 水以完成 5 mL 的体积。
使用吸管离心并小心丢弃上清液。
再重复四次水提取步骤 D11 - D12。
加入 5 mL 的氯仿：甲醇：水(1:1:0.3)，并通过涡旋剧烈重新悬浮颗粒。
离心机。
注意：离心后，通常会在上清液中看到两相而不是一相。如果是这种情况，请使用滴管小心地逐滴添加甲醇，直到仅观察一个相。
将上清液收集在新的玻璃管中，并在室温下使用气流开始干燥样品。可以通过在较高温度下干燥上清液来加速该过程，将管置于气流下的水浴中，温度不超过 40 °C（参见图 2）。

图 2. 用于干燥样品的水浴和适应气流的示意图。
用于鱼缸的商用气泵被用来提供气流。

同时，将 5 mL 的氯仿：甲醇：水(1:1:0.3) 添加到步骤 D15 中获得的剩余颗粒中，并通过涡旋混合。离心机。
使用滴管收集新的上清液，并在干燥时将其与步骤 D15 中获得的上清液混合。
重复步骤 D16 – D17 三次。在该提取步骤结束时，从单个样品中收集的所有上清液将在同一管中汇集和干燥。如果需要，可以将最终干燥的样品保持在 -20 °C 过夜，并在第二天继续执行其余步骤。
将 1 mL 的 0.02 M HCl 添加到干燥的提取物中，并将样品在水浴中煮沸 15 分钟。如果样品被冷冻，在沸腾前 5 分钟在室温下放置，以避免玻璃管因温度对比而破裂。
注意：酸水解步骤对于将聚糖与多醇部分分离是必要的。
将煮沸的样品放回室温并等待它们冷却。
依次向每个样品中加入 3 mL 氯仿和 2 mL 甲醇，并通过涡旋混合。
离心机。
在步骤D23之后，将形成两个阶段。使用吸管回收新玻璃管中的上相（水相），吸管的尖端先前已向上弯曲以避免收集任何下相。缓慢而小心地去除水相，以避免相混合。
通过暴露在室温下的恒定气流开始干燥水相。
加入 1 mL 的氯仿：甲醇：水（1:16:16），预先制备并离心，清洗剩余的下相。
使用带有弯曲尖端的吸管再次收集上层相，并在干燥时将其与前一个水相混合。等待汇集的样品完全干燥。通过将干燥的样品保持在-20°C，可以在此处暂停协议。

色谱法（72 – 82 小时）
在室温下将干燥的样品重新悬浮在 52 μL的 Milli Q 水中。
在计数瓶中测量 2 μL等分试样并添加 1 mL 闪烁液，检查样品是否已正确标记有放射性试剂。使用闪烁计数器测量放射性。检查等分试样是否超过 200 – 300 CPM。
注意：从这一步开始，您可以选择通过纸色谱法（此处提供的协议）或 HPLC 分析样品，如Stigliano 等人所述。（2011 年）。
将剩余的 50 μL样品逐滴加载到色谱纸上，如图 3 所示。在将纸放入色谱室之前，让样品在那里干燥。
使用 1-丙醇:硝基甲烷:水 (5:2:4) 通过递减色谱法运行样品。大约 50 mL 的 1-丙醇：硝基甲烷：水应添加到容纳纸张顶部的腔室中（参见图 3）。重要的是，必须每天至少监控一次运行，以防止纸张干燥。如果需要，向腔室中添加更多溶剂。平行运行（同一张纸）放射性标准品很重要，因为它们将用于识别每个峰后面的聚糖种类（图 3）。这些标准可以从标记的鸡输卵管中获得，如Parodi先前所述等。 (1981) ，或通过从已知结构的庞贝酵母菌株中纯化 N-聚糖，如Fernandez中所述等。（1994 年）。一旦您执行此协议并清楚地识别纯峰的身份，您也可以使用这些 LLO 作为标准。在 25 °C 下，70 到 80 小时的运行时间将提供标准峰的最佳分离，具体取决于聚糖种类。为了监测色谱的速度，可以在不同的色谱纸（外标）上平行运行额外的标准样品。因此，本文可以单独处理得到参考峰在 48 h 时的位置，并据此决定何时停止主运行。

图 3. 色谱纸的设计和上样。
(A) 色谱纸的推荐布局。在这种情况下，绘制了四个跑步轨迹。至少应使用这些跟踪中的一个来并行运行由已知标记聚糖种类组成的内标样品。 (B) 在将色谱纸挂在色谱室之前应如何折叠色谱纸的指示。 (C) 应在每条路径中加载样本的区域的详细信息以黄色突出显示。 (D) 显示如何将样品装入纸张的说明性图片。 (E) 色谱室示意图和挂在里面的色谱纸。

从色谱室中取出纸张，风干，然后将每个泳道切成 4 厘米× 1 厘米的部分。将每个分数放入计数瓶中，加入 0.5 mL 闪烁液。当纸张嵌入时，液体没有必要覆盖纸张。
使用带有14 C 辐射程序的闪烁计数器量化每个管子的放射性信号。

数据分析

要获得 LLO 物种的放射性剖面，请在以下链接中包含的 Excel 表中绘制信号强度（每分钟计数，CPM）与运行长度 (cm) 的关系。例如，图 4A 显示了野生型和Δalg8/Δalg12获得的代表性色谱图庞贝突变株（Gallo 等。 , 2022) 。 LLO 模式是在标准化条件下测量的（参见协议的程序 A - C），必须在所有实验中一致地使用。因此，由于这些模式几乎完全取决于测试菌株的基因型，因此此处描述的技术（同时处理大量细胞）会产生稳健而可靠的结果，从复制到复制具有高水平的再现性，以及不同的实验室。然而，需要执行至少两个独立的复制。

图 4. 去卷积之前和 (B) 之后的标记样本 (A) 的代表性配置文件。
粟酒裂殖酵母中发现的 LLO 聚糖模式野生型菌株和 Δalg8/Δalg12 突变菌株。在野生型菌株中，可以识别出一个单峰（G3M9），而在突变菌株中发现了两个不能很好分辨的峰（分别属于 G1M7 和 M7）。由 G3M9、M9、M8、M7、M6 和 M5 组成的标记的N-聚糖混合物的运行距离显示在配置文件上方。

使用应用于获得的色谱图谱的高斯拟合，通过反卷积过程量化样品中每个物种的比例。
注意：数据分析策略是结合一个或多个高斯函数对测量的轮廓进行非线性拟合。包含的 Excel 表“ DeconvolutionDataSheet.xlsx ”在同一配置文件上实现了多达七个独立的高斯函数的拟合。该过程遵循用于优化的最小二乘拟合标准。
将获得的配置文件加载到 Excel 表中，作为运行长度 (cm) 和计数 (CPM) 配对数据列表（从 A12 到 B61 的单元格）（参见图 5）。

图 5. 执行数据分析所需的 Excel 数据表。
Excel 表显示峰数及其参数（左上）、数据（左下）、未处理数据的图（右上）和处理后的数据（右下）。请注意，必须为每个菌株使用一张新表。

启用一个或多个高斯函数以拟合测量的轮廓，在第 7 行的 D 到 J 列中设置值“1”。将值设置为“0”以禁用。
注意： _
从 D 到 J 的每一列对应一个独立的高斯函数。
将高斯函数值计算为：

G=Height∙e^(-(RL-Center)^2/(2∙〖Whidth〗^2 ))

将单元格 D2 中的基线值设置为计数中测量的最小值。
注意：使用恒定值作为基线，以便在需要时减去基本信号。
对于每个启用的功能（D 到 J 列），为每个峰高、中心和宽度（第 3-5 行）设置近似值。使用右侧的图作为视觉辅助，以尽可能接近预期结果来猜测初始参数。
总结每个数据点的基线和所有启用的高斯函数（单元格 C12-C61）。
注意：计算优化函数（在单元格 C2 中）如下：

ϵ=〖log〗_10 ∑_(i=1)^n▒(F_i-〖cpm〗_i )^2

在哪里

F_i=baseline+∑_(j=1)^7▒G_i^j

从 Excel 菜单中打开数据/求解器。
完成求解器参数如下：
目标：$C$2
至：敏
更改单元格（您必须在此处定义要在拟合优化中使用的参数范围）
方法：GRG非线性

拟合高斯函数的数量更改单元格，求解器参数
1 $D$2; $D$3:$D$5
2 $D$2; $D$3:$E$5
3 $D$2; $D$3:$F$5
4 $D$2; $D$3:$G$5
5 $D$2; $D$3:$H$5
6 $D$2; $D$3:$I$5
7 $D$2; $D$3:$J$5

按解决按钮并等待执行。然后，接受以保留 Solver 解决方案。
从第 8 行 D-J 列中读取每个波段的比例区域。
注意：根据调整后的参数计算每个波段的面积：

Area=2π∙Height∙Width

比较重复的配置文件，并对每个菌株中的每个物种进行平均。

公式定义或参考：
G : 高斯函数的值
高度：表示峰的最大 CPM 的拟合参数
RL ：实验色谱运行长度，单位为 cm
中心：拟合参数，以厘米为单位指示峰值最大值的位置
宽度：与峰宽相关的拟合参数（以 cm 为单位）
𝜖 : Solver 用来实现拟合的函数
Cpm ： CPM 中每个 RL 的实验测量
面积：识别带的相对量化

笔记

这种去卷积过程在区分重叠波段时存在限制。
空间分辨率降低可能会影响结果。

食谱

添加腺嘌呤 (YEA) 的酵母提取物培养基
试剂最终浓度数量
酵母抽提物 5克/升 5克
葡萄糖 30克/升 30 克
腺嘌呤 75毫克/升 75 毫克
H 2 O 不适用完成至 1 L
全部的不适用 1,000 毫升
在 120 °C 下高压灭菌 20 分钟

不含葡萄糖的酵母氮碱 (YNB)
试剂最终浓度数量
YNB 1% 10 克
H 2 O 不适用完成至 1 L
全部的不适用 1,000 毫升
在 120 °C 下高压灭菌 20 分钟

用于标记 500 μL样品的放射性溶液
试剂最终浓度数量
[ 14 C]-葡萄糖 200 μCi 200微升。完全干燥
葡萄糖 (1 M) 50毫米 2.5微升
1% YNB 不适用 50微升
全部的不适用 50微升

氯仿:甲醇:水(1:1:0.3)
试剂最终浓度数量
氯仿不适用 435 毫升
甲醇不适用 435 毫升
H 2 O 不适用 130 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

氯仿:甲醇:水(1:16:16)
试剂最终浓度数量
氯仿不适用 30 毫升
甲醇不适用 485 毫升
H 2 O 不适用 485 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

0.02 N 盐酸
试剂最终浓度数量
盐酸37%（发烟） 0.02 牛 0.83 毫升
H 2 O 不适用完成至 500 mL*
全部的不适用 500 毫升
*注意：切勿在酸中加水。将一些蒸馏水放入容量瓶中，加入发烟 HCl，然后加水至 500 mL。

致谢

这项工作得到了Agencia Nacional de Promoción的支持 Científica y Tecnológica ( ANPCyT , Argentina) [PICT2017-1076 to C.D'.] 和国家研究委员会 (CONICET, Argentina) [PIP-11220150100759 to CD]。 CD 是国家研究委员会（CONICET，阿根廷）的职业调查员。 AV 和 GLG 是 CONICET 研究员。该协议源自原始论文 ( Gallo et al., 2022 )。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Aebi, M. (2013)。 ER中的N-连接蛋白糖基化。 Biochim Biophys Acta 1833（11）：2430-2437。
Cali, T.、Vanoni, O. 和 Molinari, M. (2008)。新合成多肽链的内质网十字路口。 Prog Mol Biol Transl Sci 83：135-179。
Chang, IJ, He, M. 和 Lam, CT (2018)。先天性糖基化障碍。 Ann Transl Med 6（24）：477。
Chapman, AE 和 Calhoun, JC t。（1988 年）。葡萄糖饥饿和嘌呤霉素处理对体内和体外中国仓鼠卵巢细胞脂联寡糖前体和生物合成酶的影响。 Arch Biochem Biophys 260（1）：320-333。
Fernandez, FS, Trombetta, SE, Hellman, U. 和 Parodi, AJ (1994)。将来自粟酒裂殖酵母的 UDP-葡萄糖：糖蛋白葡糖基转移酶纯化至同质，而来自酿酒酵母的酶明显不存在。 J Biol Chem 269（48）：30701-30706。
Gallo, GL, Valko, A., Herrera Aguilar, N., Weisz, AD 和 D'Alessio, C. (2022)。一种新型裂变酵母平台，用于模拟 N-糖基化和 I 型先天性糖基化疾病的基础。 J细胞科学135（5）。
Gershman, H. 和 Robbins, PW (1981)。葡萄糖饥饿对哺乳动物细胞中多列酚连接寡糖合成的短暂影响。生物化学杂志 256（15）：7774-7780 。
哈根，IMC，上午；格拉勒特，A。护士。 P.（2016 年）。裂变酵母：实验室手册。冷泉港实验室出版社。国际标准书号：978-1-621820-82-6。
Ng，BG 和 Freeze，HH（2018 年）。对糖基化及其先天性疾病的看法。趋势基因34（6）：466-476。
Ondruskova, N.、Cechova, A.、Hansikova, H.、Honzik, T. 和 Jaeken, J. (2021)。先天性糖基化障碍：2020年依然“热”。 Biochim Biophys Acta Gen Subj 1865(1): 129751。
Parodi, AJ, Quesada Allue, LA 和 Cazzulo, JJ (1981)。锥虫类 Crithidia fasciculata 中蛋白质糖基化的途径。 Proc Natl Acad Sci USA 78（10）：6201-6205。
Stanley, P.、Taniguchi, N. 和 Aebi, M. (2015)。在：N-聚糖。 rd, Varki, A., Cummings, RD, Esko, JD, Stanley, P., Hart, GW, Aebi, M., Darvill, AG, Kinoshita, T., Packer, NH 等。 (Eds.)糖生物学基础。 99-111。
Stigliano, ID, Alculumbre, SG, Labriola, CA, Parodi, AJ 和 D'Alessio, C. (2011)。葡萄糖苷酶 II 和 N-聚糖甘露糖含量调节体内单葡萄糖基化物种的半衰期。分子生物学细胞22（11）：1810-1823。
威尔逊，国会议员和马蒂斯，G.（2021 年）。先天性糖基化障碍的进化遗传景观。 Biochim Biophys Acta Gen Subj 1865（11）：129976。