材料和试剂

384孔黑色平底标准体积微孔板（Greiner Bio-One FLUOTRAC 200，目录号：781076）
铝粘合板密封件（Sigma-Aldrich，目录号：Z721557）
1.5 毫升 Eppendorf 管
15 毫升锥形管
50 毫升锥形管
根据 SDS-PAGE 凝胶电泳，纯度至少为 95% 的重组人 PTP：全长 SHP2 野生型 (SHP2-WT)、SHP2 催化结构域 (SHP2cat,aa 237 – 529)、PTP1B (aa 1 – 300 )、全长 STEP 46和全长 VHR。
用于激活 SHP2-WT 的双磷酸化 IRS-1 肽（由PepMic合成，苏州，中国）
Bis-Tris（Research Product International，目录号：B75000）
氯化钠（NaCl，Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
EDTA四钠盐二水合物（ BioWorld ，目录号：40500024）
3- O-甲基荧光素磷酸环己基铵盐（OMFP；内部合成）
6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯（ DiFMUP ； ThermoFisher Scientific，目录号：D22065）
Tween 20（Fisher Bioreagents，目录号：BP337）
DL-二硫苏糖醇（DTT； BioWorld ，目录号：40400120）
二甲基亚砜（DMSO；Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
Milli-Q 水：使用 Millipore Milli-Q 实验室水系统净化的水
双三缓冲液（见配方）
DMSO 中的 10 mM OMFP 原液（参见配方）
10 mM DiFMUP水溶液（见配方）
1 M DTT 原液（见配方）

设备

带有 360 nm、460 nm、485 nm 和 535 nm 滤光片的荧光酶标仪（Tecan、Spark Multimode Microplate Reader）
带摆桶转子的台式离心机（Eppendorf，5810R，配备 A-4-62 转子和 MTP 桶）
Multidrop TM Combi 试剂分配器（ Thermo Fisher Scientific，目录号：5840300）
小管分配盒（ Thermo Fisher Scientific，目录号：24073290 或 24073295）
E1-ClipTip TM多道移液器（ Thermo Fisher Scientific，各种容量）
Echo ® 555 液体处理器（ Labcyte ）
注意：为了使板降速，使用 Eppendorf 台式离心机，转速为 1,000 rpm（约 172 × g ）。

软件

化学和生物信息系统 (CBIS, ChemInnovation Software, Inc.)
GraphPad Prism TM v.9 (GraphPad Software, LLC.)
Magellan TM数据分析软件 (Tecan)
微软® Excel (微软)
注意：可以使用 Magellan、GraphPad Prism 或 Excel 计算动力学进展曲线的斜率。 Michaelis–Menten 参数可以在 GraphPad Prism（或等效程序）中计算。 GraphPad Prism 和 CBIS 都允许直接分析剂量反应数据和计算 IC 50值。 CBIS 的优势在于为分析更大的数据集提供了一个更加自动化和方便的环境。

程序

DiFMUP或 OMFP进行 PTP 活性测定
注意：以下程序可用于确定抑制测定的合适 PTP 浓度，并比较或确认重组 PTP 批次的比活性。

在冰上解冻蛋白质原液并轻轻混合。
准备 50 mL 的底物缓冲液(SB)：将 5 μL 的 Tween-20 添加到 50 mL 的 Bis-Tris pH 6 缓冲液中（详见食谱）。
注意：在室温下储存 SB 不超过一周。或者，将 SB 在 4°C 的黑暗中储存数月或冷冻以进行长期储存。
准备 10 mL 的酶缓冲液(EB)：将 50 μL 的 1 M DTT 库存溶液添加到 10 mL SB。
注意：将 EB 在冰上放置不超过 8 小时。
准备 1 mL 的 500 nM酶中间溶液 (EIS)。使用 EB 将 PTP 库存溶液稀释至 500 nM并保持在冰上。
通过 EIS 的连续稀释和使用 EB，以 1.25 ×最终浓度制备 PTP 酶溶液 (ES)（每个 100 μL）。例如，对于 OMFP 测定，将酶溶液制成 12.5 nM (ES1)、6.25 nM (ES2)、3.12 nM (ES3)、1.56 nM (ES4) 和 0.781 nM (ES5)，最终酶浓度为 10 nM ， 5 nM 、2.5 nM 、1.25 nM和 0.625 nM。对于DiFMUP检测，通常需要较低的 PTP 浓度。例如，将酶溶液制成 3.12 nM (ES1)、1.56 nM (ES2)、0.781 nM (ES3)、0.391 nM (ES4) 和 0.195 nM (ES5)，最终酶浓度为 2.5 nM 、1.25 nM 、0.625 nM 、0.312 nM和 0.156 nM （图 2A ）。

表 1.标题

使用多通道移液器，手动将 EB 和 ES 分配到 384 孔检测板中。将 20 μL 的 EB 添加到井 A1 – E1（无酶控制）。将 20 μL 的 ES1 添加到井 A2 – A5（用于一式四份测量）。同样，将 ES2 /3 /4 /5 分别添加到井 B2 – B5、C2 – C5、D2 – D5 和 E2-E5 中（图 2B ）。

图 2. PTP 活性测定的酶系列稀释方案 (A) 和测定板布局 (B)。
EIS，酶中间体溶液； ES，酶溶液； EB，酶缓冲液； SS，底物溶液； BG，背景。

带有摆桶转子的台式离心机，将板固定几秒钟，用盖子（或额外的板）盖住板，并在室温下孵育 20 分钟。
使用 10 mM 基板库存溶液和 SB，以 5 ×最终浓度制备 1 mL基板溶液(SS) 。使用接近K m值的最终底物浓度。如果不知道 PTP 基板的K m ，则选择 50 μM 作为基板浓度，例如，制作 250 μM SS。 SS 在室温下避光保存直至使用。为每个实验准备新鲜的。
将酶标仪设置为在动力学模式下读取 30 分钟（请参阅有关酶标仪设置的说明）。
使用多道移液器，向每个孔（A1 到 E5）添加 5 µL SS，立即将板离心几秒钟，并使用酶标仪开始测量。
使用 Magellan（Tecan 读板器软件）、GraphPad Prism、Microsoft Excel 或类似程序从斜坡计算回归系数 (R 2 ) 和初始速度率 ( V )。代表性数据如图 3所示。

图 3. 连续（动力学）磷酸酶活性测定。
(A)或DiFMUP的代表性 PTP 活动进展曲线 (B)作为基材。图表显示在 30 分钟内每分钟读取的相对荧光单位 (RFU) 的荧光强度值，用于与指定浓度的 PTP1B 或酶缓冲液（EB；无酶对照，背景）的反应。每个数据点代表四个反应孔的平均值 ± 标准偏差 (SD)。对数据进行了简单的线性回归。下表给出了初始速率V （斜率）、回归系数 (R 2 )、信噪比 (S/B) 和信噪比 (S/N) 的值。从 10 分钟时间点的相对荧光值计算 S/B 和 S/N 比率。

注意：确定用于抑制测定的合适酶浓度的主要标准是 PTP 反应的线性以及反应的 S/B 和 S/N 比。线性回归系数R 2 > 0.99 可以假设 30 分钟反应的线性。从 10 分钟时间点的原始荧光发射值计算的 S/B 和 S/N 比率应 > 10。（10 分钟时间点对应于我们推荐用于动力学抑制测定的 PTP 反应长度。）从 PTP1B 与 OMFP 反应的进展曲线来看（图 3A ），我们建议 PTP1B 浓度为 2.5 nM ，这会产生可接受的线性度以及 S/B 和 S/N 比。从 PTP1B 与DiFMUP反应的进展曲线（图 3B ）可以明显看出，在前两个 PTP1B 浓度（2.5 nM和 1.25 nM ）下，底物在 30 分钟反应期内完全耗尽。在 0.625 nM PTP1B 时，进展曲线在 20 分钟后仍开始平稳，导致 R 2为 0.98。测试的最低两个 PTP1B 浓度（0.312 nM和 0.156 nM ）在本实验中产生可接受的线性。

DiFMUP的 SHP2-WT 活性测定
注意：SHP2-WT 采用自抑制构象，其中它的两个 SH2 结构域之一阻止对活性位点的访问。为了测定 SHP2-WT 活性和测试 SHP2 抑制剂，源自胰岛素受体底物 1 (IRS-1) 的双磷酸化肽用作替代结合蛋白并用于激活 SHP2-WT ( Raveendra-Panickar et al., 2022 ) .下面描述的过程确定了 SHP2-WT 激活的最佳 IRS-1 浓度。

在冰上解冻蛋白质原液并轻轻混合。
按照 A 节中的说明准备 SB、EB 和 EIS。
×最终浓度 (1 mL)制备 SHP2-WT ES 。例如，对于 0.5 nM的最终 SHP2-WT 浓度，制作 1.25 nM ES：将 2.5 μL 的 SHP2-WT EIS 添加到 997.5 μL EB，轻轻混合，并保持在冰上。
使用 1 mM 肽原液在 EB 中以 2.5 ×最终浓度制备 IRS-1 肽的连续稀释液。选择广泛的稀释度，例如 10 µM、5 µM、2.5 µM、1.25 µM、0.625 µM、0.3125 µM、0.15625 µM 和 0 µM，最终浓度为 4 µM、2 µM、1 µM、0.5 µM， 0.25 µM、0.125 µM、0.0625 µM 和 0 µM（图 4A ）。
在冰上准备八个 1.5 mL Eppendorf 管。
将 198 μL 的 EB 分配到管 1 中。
将 100 μL 的 EB 分配到管2-8中。
将 2 μL 的 IRS-1 库存溶液添加到管 1 中，然后轻轻混合。
将 100 μL 从管 1 转移到管 2 中并通过轻轻上下移液进行混合。
继续连续稀释直到管 7。
从管 7 中丢弃 100 μL 的溶液。
将 100 μL 的 SHP2-WT ES 添加到八个管中的每个管中，并在冰上孵育 20 分钟。
将溶液分配到 384 孔检测板进行一式四份实验（图 4B ）。
将20 μL 的 EB 添加到井 A1 – A4（无酶控制）。
将20 μL 的管 8 添加到井 B1 – B4（SHP2-WT ，无肽）。
将20 μL 的管 7 添加到井 C1 – C4（SHP2-WT ，最低肽浓度）。
继续使用管 6 到 1，分配至孔 D1 – D4、E1 – E4、F1 – F4、G1 – G4、H1 – H4、I1 – I4 。

图 4. SHP2-WT 活性测定的 IRS-1 滴定。
(A) IRS-1 肽系列稀释方案。 (B)化验板布局。添加 20 µL 酶缓冲液（EB；背景控制）或酶溶液 (ES)，然后是 5 µL 底物溶液 (SS)。 (C)在使用DiFMUP (100 µM)作为底物的不同 IRS-1 肽浓度存在下， SHP2-WT (0.5 nM ) 活性（表示为初始速度V）。为了比较，包括不含 IRS-1 肽的重组 SHP2 催化结构域 (SHP2cat; 0.5 nM ) 的活性。酶缓冲液用于无酶对照实验。数据代表平均值±SD。使用非配对t检验确定 IRS-1 激活 SHP2-WT 的统计显着性（n = 4； ns .：不显着；**** p < 0.0001）。

将板旋转几秒钟，盖上板，在室温下孵育 20 分钟。
×最终浓度 (1 mL)制备 SS 。添加 50 µL DiFMUP库存溶液至 950 μL 的SB，以制造 500 μM DiFMUP SS，最终DiFMUP浓度为 100 μM。 SS 在室温下避光保存直至使用。为每个实验准备新鲜的。
将酶标仪设置为在动力学模式下读取 10 分钟（请参阅有关酶标仪设置的说明）。
使用多通道移液器，将 5 μL 的 SS 添加到每个井（A1 到 I4）。立即将板旋转几秒钟，然后使用酶标仪开始测量。
使用线性回归分析荧光强度数据，并使用 Magellan（Tecan 读板器软件）、GraphPad Prism、Microsoft Excel 或类似程序等程序从斜率计算 R 2和V。
注意：如图 4C所示，在 IRS-1 肽浓度为 500 nM时， SHP2-WT 的最大激活达到了，我们在之前描述的 SHP2-WT Michaelis-Menten 和抑制测定中使用了它（ Raveendra-Panickar等人., 2022)。

Michaelis-Menten 动力学
注意：Michaelis – Menten 实验的目的是确定特定分析条件下特定 PTP 的所选底物的 Michaelis – Menten 常数 (K m )。 K m值对于抑制测定很重要，其中底物通常以等于 K m的浓度使用。这使得不同 PTP 之间的抑制剂 IC 50值具有可比性。

在冰上解冻蛋白质储备溶液并轻轻混合。
按照 A 节中的说明准备 SB、EB 和 EIS。
以 1.25 ×最终浓度 (2 mL) 制备 ES 并保持在冰上。
注意：本实验的合适最终酶浓度应基于 PTP 活性测定（A 部分）的结果。
×最终浓度制备一系列底物稀释液（图 5，步骤 1 ）。准备八到十个不同的 SS，浓度大约为三个数量级。例如，在 1 mM 处制备最高浓度的 SS（最终浓度为 200 μM）并进行 1:1 连续稀释。使用多通道移液器在 384 孔板中准备连续稀释，以便于转移到反应孔中。
在 Eppendorf 管中制备最高浓度的 SS (SS1)。例如，将 10 μL 的 10 mM 基板库存溶液与 90 μL 的 SB 混合，用于 1 mM 的 SS1。
将 30 μL 的 SS1 添加到 384 孔测定板的 A6 孔中。
将 30 μL 的 SB 添加到井 B6 – J6。
通过轻轻上下吹打，将 30 μL 的 SS1 添加到 B6 孔中并混合。
将 30 μL 从井 B6 转移到井 C6 并通过轻轻上下移液进行混合。
通过井 J6 继续连续稀释。
将 20 μL 的 EB 添加到井 A1 – J1（用于背景校正的无酶控制）。
将 20 μL 的 ES 添加到 A2 - J4 孔（每种底物浓度的酶反应孔一式三份）（图 5，步骤 2 ）。
将板旋转几秒钟，盖上板，在室温下孵育20 分钟。
将酶标仪设置为在动力学模式下读取 10 分钟（请参阅有关酶标仪设置的说明）。
使用多道移液器，将 5 µL 的 SS 从第 6 列（A - J 行）转移到第 1-4 列（ A - J 行）（图 5，步骤 2 ）。立即将板旋转几秒钟，然后使用酶标仪开始测量。

图 5. Michaelis-Menten 动力学测定的底物系列稀释方案和测定板布局。
×最终浓度制备底物系列稀释液 (1:1) 。在第 2 步中，将 5 µL 每种底物溶液 (SS) 转移到第 1 列中，该列用作背景对照并包含 20 µL 酶缓冲液 (EB)，第 2 – 4 列用作一式三份 PTP 反应孔并含有 20 µL 酶溶液 (ES)。

使用线性回归分析第 1 – 4 列（A – J 行）的荧光强度数据，并使用 Magellan（Tecan 读板器软件）、GraphPad Prism、Microsoft Excel 等程序从斜率计算 R 2和V。
使用 Michaelis – Menten 方程和非线性回归以及 GraphPad Prism 等程序分析背景校正的V值。图 6显示了使用带有 OMFP 的STEP 46的代表性 Michaelis - Menten 实验的数据。

注意：重要的是要确保 PTP 反应在分析中包含的所有浓度的线性范围内。如有必要，调整酶浓度。确保底物浓度涵盖低于和高于 K m值的浓度范围。对于 SHP2-WT，Michaelis - Menten 实验应在 IRS-1 肽存在的情况下进行，其浓度如 B 节中确定。含有 IRS-1 肽的 SHP2-WT ES 应按照 B 节中的说明制备。

图 6. Michaelis – Menten 动力学。
(A)初始速度 ( V ) 以相对荧光单位/分钟 (RFU/min) 为单位，使用指定浓度的 OMFP进行步骤46 (2.5 nM ) 的 Michaelis – Menten 实验。使用 Magellan Tecan Microplate Reader 软件从原始荧光发射数据计算酶缓冲液 (EB) 对照（ V对照(EB) ；背景）和 STEP 46反应一式三份 ( V 1-3 ) 的初始速率。 (B) Michaelis – Menten 图，使用来自 (A)的第 46步的背景校正初始速率 ( V 1-corr , V 2-corr , V 3-corr ) 。将数据（表示为平均值 ± SD）拟合到 Michaelis - Menten 方程模型（eq. 5），并使用GraphPad Prism计算 Michaelis - Menten 常数 ( K m ) 。虚线表示 STEP 46的最大速度 ( V max ) 和半最大速度 ( V max /2)。

10 点剂量反应 PTP 抑制试验
注意：我们使用Labcyte Echo ® 555 液体处理器通过声学液滴分配来发现 DMSO（用于对照）和 DMSO 中的化合物溶液（用于 10 点剂量反应）。对于总检测体积为 25 μL的标准体积 384 孔检测板，我们将 250 nL DMSO 溶液转移到每个孔中。对于使用移液器手动转移化合物储备溶液，我们建议转移不少于 1 μL （出于准确性原因）并保持最终 DMSO 浓度≤5%。我们建议测试至少四个对数步长的广泛化合物浓度（例如，100、33、11、3.7、1.2、0.41、0.14、0.045、0.015、0.005 μM最终化合物浓度）。为 ES 和 SS 提供的体积用于测试多达四个 384 孔检测板，并可根据需要进行调整。

准备一个黑色的标准体积 384 孔检测板。将250 nL的 DMSO 点样到阴性和阳性对照孔中（分别为第 1 列和第 2 列）。将250 nL的复合 DMSO 溶液一式三份分样到第 3-23 列中。
注意：每个 384 孔板可测试的化合物总数为 11（参见图 7A的板图）。
在冰上解冻蛋白质原液并轻轻混合。
准备 SB (50 mL)：将 5 μL 的 Tween-20 添加到 50 mL 的 Bis-Tris pH 6 缓冲液中（有关详细信息，请参阅食谱）。
注意：在室温下储存 SB 不超过一周。
准备 EB (50 mL)：将 250 μL 的 1 M DTT 库存溶液添加到 50 mL 的 SB。
注意：将 EB 在冰上放置不超过 8 小时。
准备 500 nM EIS (1 mL)。使用 EB 将 PTP 库存溶液稀释至 500 nM并保持在冰上。
在 50 mL 锥形管中以 1.25 ×最终浓度制备 ES（约 45 mL）。例如，对于 2.5 nM的最终 PTP 浓度，将 290 μL 的 EIS 添加到 46.11 mL 的 EB 中，轻轻混合，并保持在冰上。
笔记：抑制测定的合适最终酶浓度应基于 PTP 活性测定的结果（A 部分）。对于 OMFP 实验，我们通常使用 2.5 或 5 nM PTP 最终浓度。对于DiFMUP的实验，我们通常使用 ≤0.5 nM PTP 最终浓度。
×最终基板浓度制备 SS（约 15 mL）。例如，对于 6 μM 的最终基板浓度，将 45 μL 的 10 mM 基板库存溶液添加到 14.955 mL 的 SB 中，混合并在室温下在黑暗中储存，直到使用。
注意：特定 PTP 的最终底物浓度由Michaelis-Menten 实验（C 部分）中获得的底物 K m值确定。
使用多通道移液器，将 20 μL 的 EB 添加到斑点 384 孔检测板的第 2 列（阳性对照）。
使用Multidrop TM Combi 试剂分配器，将 20 µL ES 添加到所有孔中，第 2 列中的孔除外。
使用带有摆桶转子的台式离心机，将板离心几秒钟，盖上盖子（或额外的板），并在室温下孵育 20 分钟。
将酶标仪设置为在动力学模式下读取 10 分钟（请参阅有关酶标仪设置的说明）。
使用Multidrop TM Combi 试剂分配器，将 20 µL SS 添加到整个板中，立即将板旋转几秒钟，然后使用酶标仪开始测量。
使用线性回归分析荧光强度数据，并使用 Magellan（Tecan 读板器软件）、GraphPad Prism、Microsoft Excel 或类似程序等程序从斜率计算 R 2和V。确保 PTP 反应的线性度是可接受的，并且 Z' 值≥0.5。有关 Z' 因子定义的详细信息，请参阅下面的数据分析部分。
使用正（100% 抑制）和负（0% 抑制）控制值对初始速度进行归一化，并使用非线性回归剂量反应抑制模型（对数抑制剂与反应、可变斜率、四个参数）分析归一化数据GraphPad Prism 或 CBIS 等程序，以获得 IC 50值。来自具有 OMFP 的 VHR 的代表性 10 点剂量反应抑制测定的数据如图 7所示。

图 7. 10 点剂量反应 VHR 抑制试验的代表性数据。
(A)板设置和初始速度。第 1 列用作阴性对照（载体对照）。第 2 列用作阳性对照（不含酶）。十一种候选化合物（标有不同颜色）以 10 点剂量响应格式一式三份进行测试（100、33、11、3.7、1.2、0.41、0.14、0.045、0.015 和 0.005 μM最终化合物浓度）。孔 K23 至 P24（白色）不含 DMSO 或化合物，因此不包括在分析范围内。 (B)化验板统计数据。阳性和阴性对照的初始比率表示为平均值 ± SD。有关 Z' 因子的定义和计算，请参阅数据分析部分。 (C)归一化抑制数据和拟合 IC 50曲线的示例（IC 50 ± SE；在 GraphPad Prism 中分析）。

数据分析_

统计分析参数

信号到背景 (S/B)：

S/B=F ̅_signal/F ̅_BKGD eq.1

其中F ̅_signal和F ̅_BKGD分别是反应和背景（无酶对照）的平均荧光值。

信噪比 (S/N)：

S/N=((F ̅_signal-F ̅_BKGD))/〖SD〗_BKGD eq.2

其中〖SD〗_BKGD是背景的标准偏差（零酶反应）。

Z'-因子：
Z^'=1-(〖3SD〗_n+〖3SD〗_p)/(V ̅_n-V ̅_p ) eq 3.

其中SD n和SD p和V ̅_n和V ̅_p分别是负控制和正控制初始速度值的标准偏差和均值。 Z'-因子是测定质量的统计参数，无需测试化合物的干预（Zhang，JH 等人， 1999）。 Z' 值高于 0.5 表示可接受的测定性能。

初始速度/斜率
所有实验均以动力学模式运行，每分钟读取一次荧光强度。进展曲线的斜率在 Magellan（Tecan 读板器软件）中确定，或通过将简单的线性回归模型拟合到 GraphPad Prism 或 Excel 中的动力学数据，使用以下等式：

F=V * x+b eq.4

其中F表示以相对荧光单位 (RFU) 表示的荧光强度， x表示时间 (min)， V表示表示初始速度 (斜率；RFU/min)， b表示 y 轴截距 (1/RFU)。

Michaelis – Menten Kinetics
为了确定 Michaelis – Menten 常数K m （产生半最大速度的底物浓度），使用 Michaelis – Menten 模型和 GraphPad Prism 将数据拟合到 Michaelis – Menten 方程：

V=(V_max*c)/(K_m+c) eq.5

其中V表示初始速度， V max表示最大酶速度， c表示底物浓度。

IC 50测定
平均阳性（100% 抑制）和平均阴性（0% 抑制）对照值对初始速度进行标准化，以计算抑制百分比（% inhib ）：

%_inhib=(V_nc-V_inhib)/(V_nc-V_pc ) x 100% eq.6

其中V nc表示来自阴性对照孔（载体对照）的平均初始速度， V pc表示来自阳性对照孔（无酶对照）的平均初始速度， V inhib表示来自反应的初始速度带有特定浓度化合物的孔。
IC 50值通过非线性回归，使用CBIS或GraphPad Prism软件从％ inhib计算。将数据拟合到 log[Inhibitor] 与响应、可变斜率（四个参数）模型：

%_inhib=Bottom+(Top-Bottom)/((1+(IC50/X )^HillSlope ) eq.7

其中， Bottom和Top分别是底部和顶部平台， X是配体浓度， HillSlope是曲线的陡度。

关于Multidrop TM Combi 试剂分配器的注意事项
重要的是要完全灌注卡式管以避免塑料管中出现气泡，这可能会导致分配错误。每次使用后，用 Milli-Q 水、70% 乙醇和 Milli-Q 水彻底冲洗试管。

酶标仪设置 – OMFP 检测
实验类型：动力学循环
模式：动力学
动力学循环：11
间隔时间：1分钟
测量类型：荧光强度
模式：荧光顶读
激发：过滤器
激发波长：485 nm
激发带宽：20 nm
排放：过滤器
发射波长：535 nm
发射带宽：25 nm
增益：40 手动
镜子：自动
闪光次数：10
积分时间：40 µs
滞后时间：0 µs
稳定时间：0 ms
总动力学运行时间：9 分 59 秒

酶标仪设置 - DiFMUP检测
设置与 OMFP 检测相同，除了：
激发波长：360 nm
激发带宽：35 nm
排放：过滤器
发射波长：465 nm
发射带宽：35 nm

食谱

双三缓冲
50 mM 双三 pH 6.0、50 mM NaCl、0.5 mM EDTA
在 800 mL 的Milli-Q水中，溶解 10.5 g Bis-Tris、2.9 g NaCl 和 208 mg EDTA。用 1 M 盐酸将 pH 值设置为 6.0。加入Milli-Q 水至 1 L。在 4 °C 下储存长达一年。

DMSO 中的 10 mM OMFP 储备溶液
将 26.3 毫克 OMFP环己基铵盐溶解在 5 mL 的纯 DMSO 中。可能需要超声处理（使用超声波浴）以将 OMFP 完全溶解为透明溶液。根据需要准备等分试样，并储存在-80°C。

10 mM DiFMUP水溶液
在 3.42 mL 的Milli-Q水中溶解 10 mg DiFMUP 。根据需要准备等分试样，并储存在-80°C。

1 M DTT 原液
Milli-Q水中溶解 771 mg DTT 。根据需要准备等分试样，并储存在-80°C。

致谢

本出版物中报告的研究得到了美国国立卫生研究院的支持，奖项编号为 R01AG065387、R21AG067155、R21AI160161 和 R21CA195422（至 LT），以及 NCI 癌症中心支持赠款 P30CA030199。该项目的资金也由波兰国家科学中心提供，奖励编号为 UMO-2019/32/T/ST4/00071（给 MB）。此外，该项目的全部或部分资金来自美国国立卫生研究院国家癌症研究所的联邦资金，合同编号为 HHSN261200800001E。本出版物的内容并不一定反映美国卫生与公众服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着得到美国政府的认可。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。这里描述的协议部分来源于我们最近的研究论文（ Raveendra-Panickar 等。 , 2022 年）。

利益争夺

作者声明他们与本文的内容没有利益冲突。

参考

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Cohen, P.、Cross, D. 和Janne , PA (2021)。伊马替尼 20 年后的激酶药物发现：进展和未来方向。 Nat Rev Drug Discov 20（7）：551-569。
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