材料和试剂

1. 1.5 mL管（BIO-BIK，目录号：ST-0150F）
2. 塑料方形盘（140 mm × 100 mm，高度18 mm /EIKEN，目录号：AW2000 ）
3. 塑料培养皿（ø 85 mm，高度 20 mm /EIKEN，目录号：AP2310 ）
4. 剃须刀片(FEATHER, FA-10)
5. 微量移液器[Nichiryo，目录号：00-NPX2-2（0.1 – 2 µL）]
6. 拟南芥种子
7. 乙醇（ FUJIFILM Wako，目录号： 057-00451 ）
8. Tween 20（MP Biomedicals，目录号：194841）
9. 次氯酸钠溶液（ FUJIFILM Wako，目录号：197-02206 ）
10. Murashige和Skoog（MS）植物盐混合物（FUJIFILM Wako，目录号：392-00591）
11. Gamborg's维生素溶液1,000×（Sigma-Aldrich，目录号： G1019）
12. 蔗糖（FUJIFILM Wako，目录号：196-00015）
13. 琼脂（FUJIFILM Wako，目录号：016-11875）
14. 培养基（100 mL）（见食谱）

设备

1. 生长室（日本医化仪器，型号：LH-241S ）

程序

1. 将拟南芥种子放入 1.5 mL 管中。
2. 加入 1 mL 的 70% 乙醇并清洗种子 1 分钟。
3. 除去乙醇溶液。
4. 添加 1 mL 的 H 2 O、10 μL 的 10% Tween 20 和 50 μL 的次氯酸钠溶液，并使用涡旋混合器混合。
5. 通过轻轻倒置管子清洗种子 15 分钟。
6. 取出溶液并用无菌水冲洗种子五次。
7. 在带有培养基的塑料培养皿中播种（见食谱）。
8. 在 4°C 下孵育三天。
9. 用铝箔盖住盘子，在黑暗中种植幼苗，并在 23°C 下孵育五天。
10. 取下铝箔。在这个阶段，幼苗被细长的下胚轴黄化（图1A）。请注意，进一步的黑暗会影响幼苗的活力。
11. 在 23°C 的 10 小时光照/14 小时黑暗循环下种植幼苗五天。子叶会变成绿色（图1B）。
12. 在干净的工作台上将拟南芥幼苗转移到装有培养基[有或没有1% 蔗糖（见注释 1）] 的塑料方形培养皿中。
13. 将盘子垂直放置并在 23°C 下在 10 小时光[100 μmol/m 2 s 光合光子通量密度 (PPFD)] /14 小时暗循环下孵育植物14 天（图1C）。
14. 用剃须刀片切下胚轴（图1D）。在 20–40 分钟内，木质部分泌物将在子叶的切割面上形成液滴（图1E）。
15. 用软纸擦拭第一个液滴以避免韧皮部汁液污染，然后用微量移液器收集液滴。可以以大约 30 分钟的间隔对液滴进行采样。
16. 将收集的渗出物储存在-80°C。

拟南芥木质部分泌物的收集
(A)发芽后 5 天 ( DAG )的拟南芥幼苗，在黑暗条件下生长。 (B) 10 DAG 的拟南芥幼苗，在光/暗循环下孵育五天。 (C) 24 DAG 的拟南芥植物。 (D)用剃刀刀片切割拟南芥下胚轴。 (E) 和 (F) 木质部分泌物在下胚轴的切割面上形成液滴，这些液滴用微量移液器收集。每个液滴由一个三角形表示。

笔记

1. 在我们的研究中（Okamoto et al., 2022a ），由于目标肽基因对低碳条件有反应，拟南芥从10-24 DAG 开始在没有蔗糖的情况下培养。收集渗出液 4 h，从 360 株植物中获得约 320 µL 渗出液。将蔗糖应用于培养基可增加木质部渗出物的产量。
2. 从拟南芥中获得的木质部分泌物量太少，无法进行蛋白质组学分析（大约 1 µL /植物），因此分析拟南芥木质部分泌物的目的应该是检测感兴趣的（目标）分子。
3. 为了进行综合分析，必须从较大的植物中收集大量的木质部分泌物（见第二部分）。

食谱

1. 培养基（100毫升）
将pH调至5.7，加入0.8克琼脂；然后，在 121°C 下将溶液高压灭菌 20 分钟。

第二部分。大豆木质部渗出物的收集

材料和试剂

1. 大豆种子
2. 50 mL 离心管（Labcon，产品目录号： 3181-345）
3. 塑料方形盘（140 mm × 100 mm，高度18 mm /EIKEN，目录号： AW2000 ）
4. 硅管 [选择内径适合或略大于（小于 1 毫米）切割茎的管。就大豆而言，发芽后大约七周，下部节间的直径为 4 – 7 毫米。管的长度取决于扁平针头或微量移液器尖端的长度。当使用下面描述的扁平针头时，我们将管子切成大约 8 厘米长 [AsOne，目录号： 6-586-12（内径 4 毫米）、6-586-17（内径 5 毫米）、6-586- 20（6 毫米内径）和 6-586-25（7 毫米内径）]
5. 塑料锅（直径 150 毫米，高 127 毫米）
6. 园林剪
7. 扁针（AsOne，目录号： 1-2752-01）
8. 5 mL注射器（ TERUMO，目录号： SS-05SZ ）
9. 乙醇（ FUJIFILM Wako，目录号： 057-00451 ）
10. 蛭石
11. 粘土
12. 大豆营养液（1 L）（见食谱）

设备

1. 温室或生长室（Nippon Medical & Chemical Instruments，型号：LH-411PFQDT-SP）
2. 离心机（久保田，型号：2410）

程序

1. 将种子（小于 25 mL 以便于清洗）放入 50 mL离心管中，并加入约 40 mL的 70% 乙醇，轻轻倒置 1 分钟以清洗种子。
2. 用蒸馏水冲洗种子五次。
3. 将柔软的湿纸放在塑料方形盘子上，并将种子排列在纸上（大约 25 个种子/盘子）（图 2A）。
4. 用湿软的纸盖住种子，并在盘子上盖上盖子以保持较高的湿度（图 2B）。
5. 下，在 16 小时光（200 μmol/m 2 s PPFD）/8 小时暗循环下孵育方形盘中的种子两天。
6. 选择健康的幼苗（例如，比较长的根，绿化子叶）并将它们移植到塑料盆中的蛭石中。
7. 将盆放在生长室 [16 小时光照 ( 900 µmol/m 2 s PPFD )/8 小时黑暗、23°C和湿度不受控制] 或温室中，并提供足量的营养液。溶液应用的频率取决于植物年龄、条件和天气（在温室的情况下）。
8. 发芽后大约 7周，用花园剪剪下胚轴或下节间（下胚轴的第一个或第二个节间）（图 2C，D ）。下胚轴和下部节间太难用剃须刀片切割。
9. 通过在表面上滴水，用蒸馏水清洗切割表面。
10. 让切茎渗漏 20 分钟，以避免韧皮部汁液污染。
11. 擦拭切面和茎的侧面，并用粘土将茎包裹在切面下方（在茎周围制作一个粘土环）（图 2E）。请注意，茎侧的水滴可防止粘土粘在茎上；因此，需要将液滴完全擦掉。
12. 硅管放置并压入粘土中，以避免木质部渗出物泄漏（图 2F）。阀杆和管子之间的间隙应用粘土密封。
13. 使用带有扁平针头或微量移液器的注射器收集木质部渗出物。可以每隔 20-30 分钟对渗出液进行采样。
14. 粘土颗粒有时会污染渗出液。要将它们从木质部渗出物中除去，请在2,600 × g下离心10 分钟（最好在 4 °C 下）并将上清液转移到新管中。
15. 将木质部渗出物储存在-80°C。

图 2.大豆木质部分泌物的收集
(A) 将大豆种子放在塑料方形盘中的软湿纸上。 (B) 用湿纸盖住种子，并在盘子上盖上盖子。（C ）大豆的较低节间（从底部算起的第1个或第 2 个节间）。植物在生长室 (PPFD = 900 µmol/m 2 s) 中生长。（ D ）下胚轴或下节间用园艺剪刀剪断。 ( E )切面下方的茎被粘土包裹。 ( F ) 将硅管压在切割的茎上，木质部渗出物积聚在管中。 ( G )从节间切开到管( C - F )的装管，每株不到1分钟，适用于采集大量植物的木质部分泌物进行综合分析。

笔记

1. 当植物在温室中而不是在生长室中培养时，将获得更大量的分泌物。
2. 在温室条件下，从 12 株大豆植物 (45 DAG) 中获得了大约 60毫升的木质部分泌物，在切割茎后的五个小时内（大约5 毫升/株）。
3. 在胁迫条件下，例如低氮和盐胁迫条件下，木质部渗出物的产量会降低。在我们的案例中，当大豆植物在低氮（1.2 mM NH 4 NO 3 ）条件下培养过去五天时，在 5 小时内从 11 株大豆植物中获得了大约 20 mL 的木质部分泌物。当大豆植株在最后五天用含有 50 mM NaCl 的营养液培养时，没有获得木质部分泌物。
4. 该方法可应用于各种双子叶植物。在温室条件下，从 14 株番茄 ( Solanum lycopersicum ) 植物 (45 DAG) 中，在切割茎后的 5 小时内（约 8.6 mL/株）获得了约 120 mL 的木质部分泌物，并鉴定出 7 种内源肽（Okamoto 等人., 2022b)。

食谱

1. 大豆营养液（1L ）
将试剂溶解在脱盐水中，并将总体积调整至 1 L。
将pH 值调节至 6.0 。

致谢

这些程序是基于 Okamoto等人的。 ( 2022a ) 和冈本等人。（2015 年）。这项工作得到了 JST PRESTO (JPMJPR17Q2 to SO) 和 MEXT 优秀青年研究人员领导倡议 (to SO) 的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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14. Okamoto, S.、Tabata, R. 和 Matsubayashi, Y. (2016)。植物营养稳态所必需的长距离肽信号传导。 Curr Opin 植物生物学34：35-40。
15. Okamoto, S.、Kawasaki, A.、Makino, Y.、Ishida, T. 和 Sawa, S. (2022a)。 CLAVATA3/ESR相关2肽的长距离易位及其对根蔗糖状态的积极影响。植物生理学89（4）：2357-2367。
16. Okamoto, S.、Kawasaki, A. 和 Makino, Y. (2022b)。茄属中寡肽的表征番茄木质部渗出物。生活12：592。
17. Tabata, R., Sumida, K., Yoshii, T., Ohyama, K., Shinohara, H. 和 Matsubayashi, Y. (2014)。茎 LRR-RKs 对根衍生肽的感知介导系统性 N 需求信号。科学346（6207）：343-346。
18. Taiz, L.、Zeiger, E.、Moller IM 和 Murphy A. (2015)。植物生理学与发育，第六版。西瑙尔协会。