材料和试剂

1.6孔细胞培养板（TC板，标准F， Sarstedt ，目录号：83.3920.005）
2.48孔细胞培养板（TC处理，F-bottom，Corning™ Costar™，目录号：3548）
3.96孔细胞培养板（带盖的F底，Greiner Bio-One，目录号：655180）
4.Falcon TM圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤器卡口盖，5 mL（ Falcon TM ，目录号：352235）
5.10 厘米培养皿（无菌，VWR）
6.Parafilm ® M（Sigma-Aldrich，目录号：P7793）
7.DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：D6429），储存于 4°C
8.DMEM/F-12（ Gibco TM ，目录号：11320033），储存于 4°C
9.胎牛血清（FBS， Gibco TM ，目录号：A5256701），等分并储存在-20°C
10.胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红（ Gibco TM ，目录号：25300054），等分并储存在-20°C
11.青霉素-链霉素（10,000 U/mL， Gibco TM ，目录号：15140122），等分并储存在-20°C
12.DPBS，不含钙和镁（DPBS-/-， Gibco TM ，目录号：14190144），室温储存
13.pSpCas9-(BB)-2A-GFP（ Addgene质粒#48138；http://n2t.net/addgene:48138；RRID：Addgene_48138）
14.BbsI （10,000 单位/mL；NEB，目录号：R0539S），等分并储存在 -80 °C
15.NEBuffer TM r2.1（NEB，目录号：B7030S），储存于 4°C
16.T4 DNA连接酶（400,000单位/mL，NEB，目录号：M0202S），储存于-20°C
17.T4 DNA连接酶反应缓冲液（NEB，目录号：B0202S），-20℃保存
18.TE 缓冲溶液 1 × （TRIS–EDTA 缓冲液）pH 8,0（VWR，J75793.AE），室温保存
19.氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，69-52-3）
20.BD BACTO TM琼脂（BD，目录号：214010）
21.胰蛋白胨（Millipore，目录号：T7293）
22.酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625）
23.NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
24.Trizma ®底座（Sigma-Aldrich，目录号： TRIS-RO）
25.cOmplete TM （Roche，目录号： 11836145001）
26.Pefabloc ® SC（Roche，目录号： 11585916001）
27.IGEPAL ® CA-630（Sigma-Aldrich，目录号： 18896）
28.SDS（Sigma-Aldrich，目录号： 71729）
29.溴酚蓝（ Thermo Fisher Scientific，目录号： A18469.18）
30.甘油（Sigma-Aldrich，目录号： G5516）
31.DTT（二硫苏糖醇， Thermo Fisher Scientific，目录号：R0862）
32.TWEEN ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
33.琼脂糖粉末（Sigma，目录号：A9539）
34.GeneJuice ® 转染试剂（Merck Millipore，目录号：70967），4°C 储存
35.Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物，10 mg/mL水溶液（ Invitrogen TM ，目录号：H3570）
36.One Shot TM TOP10化学感受态大肠杆菌（ Invitrogen TM ，目录号：C404010），储存在-80°C
37.HuTu-80 细胞（CLS，目录号：330218），在液氮中扩增和冷冻保存细胞原液
38.HEK 293T (ATCC ® CRL-3216 TM )，在液氮中扩增和冷冻保存细胞原液
39.DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：W387509），等分并储存在-20°C
40.Sanger 测序试剂盒（ BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 和ExoSAP -IT, A38073），根据制造商的规格存储组件
41.NucleoBond PC，用于转染级质粒 DNA 的迷你试剂盒（MACHEREY-NAGEL，REF 740571.100），根据制造商的规格存储组件
42.血液和细胞培养 DNA 迷你试剂盒（QIAGEN，目录号： 13323），根据制造商的规格存储组件
43.RNeasy mini kit（QIAGEN，目录号： 74004），根据制造商的规格存储组件
44.SuperScript ® III 第一链合成系统（Invitrogen，目录号： 18080-051），根据制造商的规格存储组件
45.iTaq TM Universal SYBR ® green supermix （Bio-Rad，目录号： 172-5121），根据制造商的规格储存组分
46.4 – 15% Criterion TGX 预制中型蛋白凝胶（Bio-Rad，目录号：5671085），储存于 4°C
47.Trans-blot turbo midi 0.2 µm 硝酸纤维素膜（Bio-Rad，目录号：1704159），储存于 4 °C
48.Blotto，脱脂奶粉（Santa Cruz，目录号：sc-2325），室温储存
49.驴抗兔 IgG（H+L），Alexa Fluor TM Plus 800（ Thermo Fisher Scientific，目录号：A32808）
50.Alexa Fluor® 680 AffiniPure驴抗羊 IgG（H+L）（ Jackson ImmunoResearch ，目录号：713-625-147）
51.1× PBS，室温保存
52.HuTu-80 细胞的生长培养基（见配方），储存在 4 °C
53.HEK 293T 细胞的生长培养基（见配方），储存在 4 °C
54.Lysogeny 肉汤（LB；米勒配方，见食谱），储存在 4 °C
55.LB 琼脂板（见食谱），储存在 4 °C
56.10 × Tris 缓冲盐水 (TBS) 溶液（参见食谱）
57.蛋白质裂解缓冲液，4 °C 储存（参见食谱）
58.4× 样品缓冲液，4 °C 储存（参见配方）

设备

1.热循环仪（Bio-Rad，型号：C1000Touch TM ）
2.卧式凝胶电泳系统
3.分子成像仪® GelDoc XR 系统（Bio-Rad）
4.3790系列基因分析仪（赛默飞世尔科技）
5.台式轨道摇床（New Brunswick Scientific，型号：Innova ® 40/40R）
6.配备 A-4-81 转子 (Eppendorf) 的 Eppendorf 5810 离心机
7.细胞培养CO 2培养箱（三洋，型号：MCO-19AIC）
8.配备 GFP 光立方 (AMEP4951) 的台式 EVOS M5000 成像系统 (AMF5000)
9.水浴（Precision – CIR 35，Fisher Scientific）
10.高灵敏度流式细胞仪 BD FACSAria TM III (BD Biosciences)
11.CFX Opus 96 实时 PCR (Bio-Rad)
12.Heraeus Fresco TM 17 微型离心机配备 24 × 1.5/2.0 mL 转子和ClickSeal TM 生物密封盖（ Thermo Scientific ）
13.转印迹® Turbo TM传输系统（Bio-Rad）
14.Odyssey CLx成像系统 (LI-COR Biosciences)

软件

1.CHOPCHOP（第 3 版， https: //chopchop.cbu.uib.no/ ）
2.TIDE：通过分解跟踪 Indels ( http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ )
3.用于 CFX 实时 PCR 仪器的 CFX Maestro 软件 (Bio-Rad)
4.Image Studio TM Lite Ver 5.2 (LI-COR Biosciences)

程序

A.LRP10基因座的计算机设计sgRNA
1.使用 CHOPCHOP 网络工具 ( http://chopchop.cbu.uib.no ) ( Labun ) 确定最佳 CRISPR/Cas9 目标位点等。 , 2019) 或其他优选的 CRISPR/Cas9 设计工具。选择具有最高预测效率和最低预测脱靶的 sgRNA (20 bp)。最佳 sgRNA 的序列用于设计有义和反义寡核苷酸，以将 sgRNA 克隆到 pSpCas9-(BB)-2A-GFP 中（参见步骤 2）。我们建议测试针对感兴趣基因的不同外显子设计的几种 sgRNA 的靶向效率。
2.要将 sgRNA 克隆到 pSpCas9-(BB)-2A-GFP (Ran et al. , 2013)，订购具有适当BbsI突出端的有义和反义寡核苷酸 (Integrated DNA Technologies)。这些寡核苷酸需要在 5' 末端被磷酸化。重要的是，pSpCas9-(BB)-2A-GFP 允许 sgRNA 在人类 U6 启动子的控制下表达，这需要在转录起始位点有一个“ G ”碱基。因此，在 sgRNA 序列的开头添加“ G ”。对于 LRP10 KO，我们使用 sgRNA 靶向LRP10基因的第一个外显子（有序寡核苷酸：5'-P-CACC G CGTTTCGGTTCTTACCAAGG 和 5'-P-AAACCCTTGGTAAGAACCGAAACG C ）。用于生成 LRP10 KO 的目标基因组序列是根据在线 CHOPCHOP 工具的分数和针对LRP10基因不同外显子的多个 sgRNA 的先前测试选择的。

寡核苷酸设计模板：
sgRNA-oligo-FW：5'-P-CACC( G )NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
sgRNA-oligo-RV：5'-P-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN( C )-3'

P，磷酸化

B.将 sgRNA 克隆到 pSpCas9-(BB)-2A-GFP 质粒中
1.寡核苷酸退火。使用无菌软化水 (dH 2 O) 或 TE 缓冲液将寡核苷酸的浓度调整到 100 μM，并在退火反应中结合（表 1）。在 95°C 下在热循环仪中孵育反应 5 分钟。接下来，以 5°C/分钟的速度下降到 25°C。退火后的产品可在-20°C 下储存数月。

表1 。寡核苷酸退火反应的组成

2.pSpCas9- (BB)-2A-GFP 质粒设置限制酶消化(表 2)。在 37°C 下孵育 90 分钟。在 65°C 下使限制酶失活 20 分钟。在 0.8% 琼脂糖凝胶上加载 3 μL 的消化载体，以检查限制反应效率。 BbsI酶在两个位置切割质粒，从质粒中去除 22 个碱基对。由于多种质粒构象，琼脂糖凝胶上未切割的质粒 DNA 具有多条带模式（三个条带超过 7 kbp ）。 BbsI消化的质粒 DNA 显示出约 9 kbp的单带模式。
注意：通常， BbsI的切割效率很高，因此不需要从凝胶中纯化线性化载体。

表2 。 pSpCas9-(BB)-2A-GFP 消化装置

3.设置结扎反应（表 3）。结扎前，在无菌 dH 2 O 中稀释退火寡核苷酸 1:250，最终浓度为 40 nM。将连接反应在 16°C 下孵育过夜或在室温下孵育 10 分钟。在 65 °C 下加热灭活 10 分钟。根据您的内部细菌转化方案，在冰上冷却并将 1 – 5 μL反应物转化为 50 μL感受态细胞。在含有 50 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂板上将转化的细菌板（见食谱）。将盘子放在 37°C 的培养箱中过夜。

表3 。连接反应装置

4.第二天，在 37°C 和 200 rpm 下将菌落（至少六个）接种在含有 50 μg/mL 氨苄青霉素的 3 mL 细菌生长培养基（LB）中。接下来，按照制造商的规格或内部协议，使用NucleoBond PC 迷你套件进行质粒迷你制备。使用 hU6-FW 引物 (5'- GAGGGCCTATTTCCCATGATT) 和BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 或内部协议，通过 Sanger 测序验证正确的克隆。选择一个正确的克隆以继续下一步。
注意：确保您的质粒 DNA 是转染级的。从NucleoBond PC mini 试剂盒获得的 DNA 制剂适用于分子级实验，可直接用于细胞转染。

C.细胞培养和转染
1.在 37 °C 和 5% CO 2下保持 HuTu-80 细胞在生长培养基（见食谱）中。当 80% 汇合时分裂细胞。在生长培养基中维持 HEK 293T 细胞（参见食谱）在 37 °C 和 5% CO 2下。当 80% 汇合时分裂细胞。
2.转染前一天，在 6 孔板的一个孔中接种以下数量的细胞：50 万个 HEK 293T 细胞和 30 万个 HuTu-80 细胞。第二天，细胞将达到 30% – 40% 的汇合度并准备好转染。
3.在 6 孔板的一个孔中转染细胞。根据制造商的说明，使用GeneJuice ® 转染试剂对含有 sgRNA 的 pSpCas9-(BB)-2A-GFP 进行转染。
4.四十八小时后，使用配备适当光立方的台式成像系统检查转染效率，以可视化 GFP 阳性细胞。转染的细胞表达 GFP。 HuTu-80 细胞的转染效率低至中等 (10% – 30%)。 HEK 293T 细胞的转染效率很高（约 80%）。
5.在转染后 48 小时准备转染细胞用于荧光激活细胞分选 (FACS)。

D.96孔板制备
1.在 FACS 当天，通过在每个孔中添加 150 μL 的 HuTu-80 或 HEK 293T 生长培养基来制备三个 96 孔板（平底）。
2.在 FACS 之前在 37°C 和 5% CO 2下孵育板至少 30 分钟以平衡介质。

E.流式细胞仪
1.对于单细胞分选，从 6 孔板的孔中吸出培养基并用 DPBS-/- 洗涤一次。
2.将 1 mL 的胰蛋白酶-EDTA 添加到井中，并在 37 °C 和 5% CO 2下孵育5 分钟。
3.向孔中加入 1 mL 的生长培养基，轻轻重新悬浮以将细胞从板中移出，然后将细胞转移到 15 mL Falcon 管中。
4.以 1,000 rpm (198 × g ) 旋转细胞 5 分钟。
5.吸出并丢弃上清液。接下来，将细胞颗粒重新悬浮在含有 4% FBS 的 1 mL DPBS-/- 中。
6.将 1 mL 细胞溶液转移至 Falcon TM圆底聚苯乙烯试管，带有细胞过滤器卡扣盖。
7.添加 1 μL 的无菌 Hoechst 33342 溶液以标记死细胞，并通过倒置管轻轻混合。
8.通过门控双峰（基于前向和侧向散射）和死细胞（Hoechst 33342 阳性细胞）将 GFP 阳性细胞分类为三个 96 孔板（每孔 1 个细胞）。选择具有高 GFP 表达的细胞群。图 1 表示 BD FACSAria TM III 上用于 HuTu-80 细胞中 CRISPR/Cas9 介导的 LRP10 KO 的 FACS 设置。可选地，包括阴性对照样品（未转染和非赫斯特染色的细胞），以最佳地确定阳性细胞群的门控。

图 1. HuTu-80 细胞系中 CRISPR/Cas9 介导的 KO 的 FACS 分选门控设置示例。

F.分选后单细胞扩增
1.排序后立即在 37°C 和 5% CO 2下孵育板72 小时。
2.使用 150 μL 的生长培养基进行第一次培养基更换。
3.每 72 小时执行一次后续介质更换，直到在光学显微镜下观察到菌落。
4.分选后 14 天菌落开始出现。 HuTu-80 细胞可以从一个 96 孔板中得到至少 10 个克隆。对于 HEK 293T 细胞，您可以从一个 96 孔板中获得至少 30 个克隆。
5.当菌落达到 80% 汇合时，从 96 孔板中吸出培养基，用 DPBS-/- 洗涤，每孔加入 50 μL 胰蛋白酶-EDTA，在 37°C 和 5% CO 2下孵育5 分钟。
6.接下来，每口井添加 150 μL 的生长培养基，重新悬浮以去除细胞，并将每个克隆转移到单独的 15 mL Falcon 管中。以 1,000 rpm (198 × g ) 旋转。
7.丢弃上清液并将每个克隆的细胞颗粒重新悬浮在新鲜的 150 μL 生长培养基中。将一半 (75 µL) 的细胞悬浮液添加到 48 孔板 (PCR 处理板) 的新井中, 并用额外的 225 µL 生长培养基填充该井。将另一半 (75 μL) 的细胞悬浮液添加到新的 48 孔板（传播板）中，并用另外 225 μL 的生长介质填充该孔。

G.板的处理和阳性克隆的验证
1.PCR 处理板。培养克隆直到它们达到 80% 的汇合度。准备就绪后，使用内部方案或使用血液和细胞培养 DNA 迷你试剂盒提取基因组 DNA。使用LRP10外显子 1侧翼的引物（FW：CAAAGTTTGGCCCGAAGAGG，RV：GGGCAGGCAGGATAGAGTGC）通过 PCR 扩增感兴趣的 DNA 片段，并按照您的内部协议执行 Sanger 测序。手动或使用免费的网络工具（TIDE， http ://shinyapps.datacurators.nl/tide/ ）执行 INDEL 跟踪，以识别目标克隆（Brinkman 等。 , 2014)。
2.传播板。培养克隆直至达到 80% 汇合，然后按如下方式冷冻保存：吸出培养基，用 DPBS-/- 洗涤，每孔加入 50 μL 胰蛋白酶-EDTA，并在 37°C 和 5% CO 2下孵育5 分钟。在每口井中加入 300 μL含有 10% DMSO的生长培养基。用Parafilm TM包装纸将盘子包裹起来，并将它们存放在 -80°C 的冰箱中的拉链塑料袋中。细胞在筛选过程中将保持冷冻状态。当您识别出阳性克隆时，根据您的内部协议解冻并扩展所需的克隆。此外，解冻并扩展三个经过相同基因组编辑程序的未编辑克隆 ( LRP10 WT)。这些克隆可用作下游实验的控制条件。每个克隆的转录和蛋白质水平的 LRP10 的量可以通过 RT-qPCR 和蛋白质印迹进一步表征。下面，我们简要介绍用于 RT-qPCR 和蛋白质印迹实验的建议和试剂盒。

H.逆转录定量PCR
建议
1.LRP10使用以下引物组：
第 1 组（ LRP10 -N 端）：FW：ACTGCACCTGGCTCATCC 和 RV：GAGATCAGTGGCTGGAGAGG
第 2 组（ LRP10 -C 端）：FW：CCAGGAGTACAGCATCTTTGC 和 RV：TAGCAGAGAACGCAGGTTGC
2.在标准化为以下管家基因的几何平均值后，可以确定相对LRP10 mRNA 水平：
CLK2 （固件： TCGTTAGCACCTTAGGAGAGG，房车： TGATCTTCAGGGCAACTCG)
COPS5 （FW：CCAGGAACCATTTGTAGCAG，RV：GTAGCCCTTTGGGTATGTCC）
RNF10 （前锋：GCATCTGTGAACTGGCTTTG，RV： CTGACGTTTCCTCTTCTCAATG)

程序
1.按照制造商的规格，使用 RNeasy 迷你试剂盒从细胞中提取 RNA。
2.SuperScript ® III 第一链合成系统使用随机六聚体进行第一链 cDNA 合成，然后进行 RNase H 消化。遵循制造商的规格。每个 cDNA 反应使用 1 µg RNA。
3.接下来，使用iTaq TM Universal SYBR ® green supermix制备 RT-qPCR 反应。遵循制造商的规格。对于每个 cDNA 样本，准备五个单独的反应（五个不同的引物组）。每个反应包含iTaq TM Universal SYBR ® green supermix 、引物组和 100 ng cDNA。每个反应应一式三份进行（RT-qPCR 的技术复制）。
4.将 PCR 管或板装入 RT-PCR 仪器并开始 PCR 运行。我们的热循环方案针对CFX Opus 96 实时 PCR 进行了优化，具有以下条件：95 °C 下 3 分钟（初始变性）、95 °C 下 5 秒的 40 个循环和 60 °C 下 30 秒。
5.可以使用用于 CFX 实时 PCR 仪器的 CFX Maestro 软件来量化相对标准化的LRP10 mRNA 表达。

I.蛋白质印迹
建议
对于蛋白质印迹，我们建议使用浓度为 1:500 的 LRP10-NT (1-440 aa) (Sino Biological, 13228-T16) 和 LRP10-CT (463-713 aa) (MRC PPU Reagents, DA058) 抗体（格罗霍斯卡等。 , 2021)。我们推荐以下荧光偶联二抗：驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附的二抗、Alexa Fluor TM Plus 800 ( Thermo Fisher Scientific, A32808) 和 Alexa Fluor ® 680 AffiniPure驴抗羊 IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch , 713-625-147)，浓度为 1:1,000。

程序
1.× TBS清洗细胞一次（参见食谱）。随后，添加含有新添加的蛋白酶抑制剂的蛋白质裂解缓冲液（参见配方），1 × cOmplete TM和1 mM Pefabloc ® SC。
2.快速冷冻裂解物。接下来，解冻裂解物并通过在 13,000 rpm (1,628 × g ) 和 4 °C 下离心 10 分钟来清除它们。
3.将裂解物与补充有 100 mM DTT 的 4 ×样品缓冲液混合，并在 95°C 下孵育 10 分钟。
4.在 4%–15% Criterion TGX 预制凝胶上分离蛋白质。使用 Trans-Blot ®将蛋白质转移到 trans-blot turbo midi 0.2 µm 硝酸纤维素膜 Turbo TM传输系统。
5.使用封闭缓冲液 [5% 脱脂奶粉 (Blotto) 和 0.1% v/v TWEEN® 20 in 1 × TBS] 在室温下封闭膜1小时。
6.在封闭缓冲液中在 4°C 下进行一抗孵育过夜。
7.含有 0.1% v/v TWEEN ® 20的 1 × TBS洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
8.在室温下使用荧光结合的二级抗体在封闭缓冲液中进行二级抗体孵育 1 小时。
9.含有 0.1% v/v TWEEN ® 20的 1 × TBS洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
10.使用 Odyssey CLx成像系统对印迹进行成像。可以使用 Image Studio TM Lite Ver 5.2 分析图像。

笔记

在 CRISPR/Cas9 基因组编辑后，我们从 43 个克隆扩增的 HEK 293T 细胞系中提取 DNA，使用LRP10外显子 1 侧翼的引物进行 PCR，并对获得的 PCR 产物进行 Sanger 测序。使用 TIDE 网络工具（Brinkman 等。 , 2014)，我们分解了单个克隆的电泳图，以跟踪位于预期双链断裂位点的 INDEL，随后对所有克隆系进行基因分型。我们证明我们的 CRISPR/Cas9 方法针对 58.1% 的克隆扩展 HEK 293T 系中的两个等位基因（图 2A；纯合子和复合杂合子克隆相结合）。在所有分析的克隆中，4.7% 未靶向，2.3% 靶向等位基因之一，预计 34.9% 携带两个以上的 INDEL（图 2A）。一个碱基对插入是 NHEJ 双链断裂修复后最常见的突变（图 2B）。重要的是，插入一个碱基对会导致移码并经常产生过早的终止密码子。设计的 sgRNA 也非常喜欢在其他 DNA 核苷酸上插入胸苷（图 2C、D、E）。 HEK 293T（KO-1 和 KO-2，图 2D）和 HuTu-80（ KO-1 和 KO-2，图 2E）中的 1 bp 纯合插入预计会导致移码和提前终止密码子在位置 p.Gly12Trp fs*18。类似地，在 HEK 293T 和 HuTu-80 克隆中，在一条 DNA 链上插入 1 bp 而在另一条 DNA 链上缺失 2 bp 的复合杂合突变预计会导致 p.Gly12Trp 位置的移码和过早终止密码子fs*18/p.Gly12Arg fs*17（KO-3，图 2D 和 E）。

图 2. CRISPR/Cas9 介导的 LRP10 KO 在 HEK 293T 和 HuTu-80 细胞系中高效
（一个） LRP10在克隆扩展的 HEK 293T 细胞系中靶向效率。分析了来自 43 个克隆系的基因型。 WT，未经编辑的 LRP10序列。 ( B)每种突变类型（DEL：缺失；IN：插入；bp：碱基对）占目标等位基因总数的百分比。 ( C)在所有“1 bp 插入”(IN 1 bp) 等位基因中分析的 A、T、G 和 C 插入频率。 (四), (五) 来自三个独立克隆的LRP10 DNA 序列的电泳图显示 HEK 293T ( D ) 和 HuTu-80 ( E ) 细胞系中的双等位基因靶向。 Sanger 测序分析证实了含有 INDEL 的等位基因的靶向诱变。克隆 1 (KO-1) 和 2 (KO-2) 携带胸苷 (c.33dupT) 插入，克隆 3 (KO-3) 携带两个不同等位基因 (c.33dupT 和 c.32_33insG) 的插入和缺失）。三个都预计基因型会诱导导致过早终止密码子的移码（p.Gly12Trp fs*18 或 p.Gly12Arg fs*17）。

食谱

1.HuTu-80 细胞生长培养基
DMEM/F-12, 445 毫升
胎牛血清10% , 50 毫升
青霉素-链霉素1% , 5 毫升
总计： 500 毫升
2.HEK 293T 细胞生长培养基
DMEM， 445 毫升
胎牛血清10% , 50毫升
青霉素-链霉素1% , 5 毫升
总计: 500 毫升
3.LB（米勒配方）
胰蛋白胨1% (w/v) , 10 G
酵母抽提物0 .5% (w/v), 5 G
氯化钠1% (w/v) ， 10 克
dH 2 O , 加起来 1 L
准备液体 LB 介质，然后进行高压灭菌（120°C）并冷却至室温。
4.LB琼脂板
BD BACTO TM琼脂， 7 .5 g
LB（米勒配方）， 400 毫升
在 120 °C 下混合并高压灭菌。当冷却到大约 55 °C 时，加入50 µg/mL 氨苄青霉素。在无菌长凳上准备培养皿。小心地将一层薄薄的溶液倒入培养皿中（每盘约 15 mL）。避免产生气泡。将盘子放置在冰箱中之前放置。盘子可以在冰箱中保存最多两周。
5.10 × Tris 缓冲盐水 (TBS) 溶液
Trizma ®底座，24 克
氯化钠，88 克
溶于 900 mL dH 2 O
用 HCl 调节 pH 至 7.6
2 O将最终体积调整到 1 L
6.蛋白质裂解缓冲液
1 M Tris-Cl（pH 7.4，由Trizma ®碱制成的储备液）50 mM，25 mL
氯化钠 100 毫米，2.92 克
IGEPAL ® CA-630 1.0%，5 毫升
添加 dH 2 O 至 500 mL
存放在冰箱里。使用前加1 × 库存中的完整和 1 mM Pefabloc® SC 。准备一个 25 × cOmplete TM原液，将一片cOmplete TM片剂溶解在 2 mL 去离子水或 10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中。储备溶液在 -15 至 -25 °C 下可稳定至少 12 周。要制备 100 mM Pefabloc ® SC，将 100 mg Pefabloc ® SC 溶解在 4.18 mL 去离子水中。在去离子水中制备的浓缩 100 mM 储备溶液呈酸性，如果以等分试样形式储存，可在 -15 至 -25 °C 下稳定 1-2 个月。
7.4 ×样品缓冲液
1 M Tris-Cl（pH 6.8，由Trizma ®碱制成的原料），3.125 mL
20% SDS 溶液，20 mL
甘油 (v/v)，10 毫升
溴酚蓝，2 毫克
制作 800 μL 等分试样并将其存放在冰箱中。使用前，加入 200 μL 的 1 M DTT 以获得 4 ×样品缓冲液。要制备 1 M DTT 溶液，请将 1.55 克 DTT 粉末溶解在 10 mL 的去离子水中。

致谢

这项工作得到了Stichting研究基金的支持 ParkinsonFonds （荷兰）和老年痴呆症荷兰。 pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) 是 Feng Zhang 的礼物（ Addgene质粒 # 48138；http://n2t.net/addgene:48138；RRID:Addgene_48138）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

1.Adli, M. (2018)。用于基因组编辑及其他方面的 CRISPR 工具包。国家公社9 （1）：1911。
2.Boucher, R.、Larkin, H.、Brodeur, J.、Gagnon, H.、 Thériault , C. 和 Lavoie, C. (2008)。 LRP9 的细胞内运输依赖于两个酸性簇/二亮氨酸基序。组织化学细胞生物学130（2）：315-327。
3.Brodeur, J.、Larkin, H.、Boucher, R.、Theriault, C.、St-Louis, SC、Gagnon, H. 和 Lavoie, C. (2009)。 Calnuc 与 LRP9 结合并影响其内体分选。交通10(8)：1098-1114。
4.Brodeur, J.、Theriault, C.、Lessard-Beaudoin, M.、 Marcil , A.、 Dahan , S. 和 Lavoie, C. (2012)。 LDLR 相关蛋白 10 (LRP10) 调节淀粉样前体蛋白 (APP) 的运输和加工：在阿尔茨海默病中起作用的证据。摩尔神经变性剂 7：31 。
5.Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto , R., Habib, N., Hsu, PD, Wu, X., Jiang, W., Marraffini , LA 和 Zhang, F （2013 年）。使用 CRISPR/Cas 系统进行多重基因组工程。科学339（6121）：819-823。
6.Doray , B., Knisely , JM, Wartman, L., Bu, G. 和 Kornfeld, S. (2008)。鉴定 LRP9 中与 GGA 和 AP-1/AP-2 相互作用的酸性双亮氨酸信号。交通9(9)：1551-1562。
7.Grochowska，MM，Carreras Mascaro，A.，Boumeester，V.，Natale，D.，Breedveld，GJ，Geut，H.，van Cappellen，WA，Boon，AJW，Kievit，AJA，Sammler，E.，等。（2021 年）。 LRP10 在非神经元脑细胞的细胞内囊泡运输途径中与 SORL1 相互作用，并定位于帕金森病中的路易体和路易体痴呆。神经病理学学报142（1）：117-137。
8.Jinek , M., Chylinski , K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna , JA 和 Charpentier, E. (2012)。适应性细菌免疫中的可编程双 RNA 引导 DNA 内切酶。科学337（6096）：816-821。
9.Labun , K., Montague, TG, Krause, M., Torres Cleuren , YN, Tjeldnes , H. 和Valen , E. (2019)。 CHOPCHOP v3：将 CRISPR 网络工具箱扩展到基因组编辑之外。核酸研究47（W1）：W171-W174。
10.Quadri, M., Mandemakers, W., Grochowska, MM, Masius, R., Geut, H., Fabrizio, E., Breedveld, GJ, Kuipers, D., Minneboo, M., Vergouw, LJM, et al。（2018 年）。家族性帕金森病和路易体痴呆中的 LRP10 基因变异：全基因组连锁和测序研究。柳叶刀神经杂志 17(7): 597-608。
11.Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala , V., Scott, DA 和 Zhang, F. (2013)。使用 CRISPR-Cas9 系统进行基因组工程。国家协议8（11）：2281-2308 。
12.桑德，JD 和Joung ，JK（2014 年）。用于编辑、调节和靶向基因组的 CRISPR-Cas 系统。 Nat Biotechnol 32（4）：347-355。