材料和试剂
1. 铝箔
2. 过氧化氢，35% 在水中（H 2 O 2 ）（TCI，目录号：H1222，CAS RN：7722-84-1）
3. L（ +）-抗坏血酸（CAS 50-81-7）（Merck Millipore，目录号：100468）
4. 0.1 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.0）（参见食谱）
5. 反应混合物（见配方）

设备
1. 规模
2. 移液器
3. 搅拌器
4. 研钵和研杵
5. 离心机
6. 带图形 LCD 的双光束 UV-VIS 分光光度计 – Typr 2205
7. 玻璃器皿：试管、烧杯、锥形瓶、量筒和容量瓶（Slisco Scientific 和 Ace Glass Incorporated）

程序

A. 样品提取
注意：完整的提取程序必须在 0-4 进行摄氏度。在高粱植物的叶组织中测量抗坏血酸过氧化物酶活性。
1. 使用先前冷冻的研钵和研杵在 10 mL 的新鲜 0.1 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中完全均匀化 2 g 新鲜和清洁的组织样品。
2. 在温控离心机中以 11,180 × g离心匀浆 15 分钟。
3. 收集上清液作为粗提物并完全丢弃沉淀。
4. 立即使用此酶提取物进行酶测定，并将剩余的提取物保存在冰箱中用于总可溶性蛋白质的估计，这是酶比活性计算所必需的。

B. 酶测定
注：APX 采用 Nakano 和 Asada (1981) 的方法测定。仅使用新制备的试剂和提取物来估计 APX 活性。
1. 加入 3 mL 反应混合物（参见配方）并在最后加入 50 μL 酶提取物（来自步骤 A4）来启动反应。
2. 用 50 µL 煮沸的酶提取物代替酶提取物，可以同时为每个样品制备空白。
3. 使用分光光度计记录 290 nm 处的吸光度降低 2 分钟，以相对于合适的空白。
4. 酶活性可以使用下面给出的标准方程中抗坏血酸盐的2.8 mM -1 cm -1的摩尔消光系数（一摩尔溶液的吸光度）来计算。酶活性将以酶单位表示，一个酶单位对应于每分钟氧化 1 nmol 抗坏血酸所需的酶量。

吸光度的标准方程： A = ε × Ɩ × с

其中A是样品在给定波长下吸收的光量， ε是摩尔消光系数， Ɩ是光穿过溶液的距离， с是吸收物质的浓度。

注意：为了根据您的样品和仪器获得更好和更准确的结果，L-抗坏血酸、H 2 O 2和酶提取物之间的校准应在开始最终程序之前进行。

计算：
对于假定的样本量，可以如表 1 中所述计算酶活性和比活性。需要样品的总蛋白质含量来计算比活性，可以通过Lowry的方法来确定。

表 1.抗坏血酸过氧化物酶活性（单位或 nmol 抗坏血酸/分钟）

假定使用的样品：提取物是由 2 g 新鲜叶子样品在 10 mL 磷酸钾缓冲液中制成；从中提取 0.05 mL 的提取物用于测定。假设根据 Lowry 的方法在本案例中每个样品中发现 P mg/mL 蛋白质。
290 nm 处的吸光度酶活性和比活性
复制时间 0 s 15 秒 30 秒 45 秒 60 秒吸光度降低吸光度平均下降酶活性/分钟（单位）= 活性/0.05 mL 稀释因子（活性/mL 提取物）总蛋白质含量 (mg/mL) 比活性（ μmol /min/mg）
第一一个 b C d e a - e = F (F + O + X) / 3 = Y Y / 2.8 = Z (Z / 0.05) × 1 = G 磷 G / P = Q
第二 j ķ l 米 n j - n = O
第三 s 吨你 v w s - w = X

食谱

1. 0.1 M 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0)
0.5 L 1 MK 2 HPO 4在 174.18 g mol -1 = 87.09 g
0.5 L 1 M KH 2 PO 4 136.09 g mol -1 = 68.045 g
将 61.5 mL 的 1 MK 2 HPO 4与 38.5 mL 1 M KH 2 PO 4混合，在 25 °C 下制备 0.1 M 磷酸钾缓冲液 pH 7.0
2. 反应混合物
2.7 mL 100 mM 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0)
0.1 mL L(+)-抗坏血酸
0.15 毫升 H 2 O 2

致谢

这项研究得到了 CCS 哈里亚纳邦农业大学权威的财政支持。通讯作者非常感谢CCSHA大学及其工作人员在实验电导和数据分析方面的宝贵帮助。我还要感谢 HR Singal 博士鼓励我写这篇研究文章。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

参考

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