材料和试剂

冰桶（例如，带盖的 Magic Touch 2 TM冰桶；Sigma-Aldrich，目录号：BAM168072002）
玻璃珠，3 mm（Merck，目录号：104015）
容量为 1.5 mL 的微量离心管（SARSTEDT AG & Co. KG，目录号：72.690.001）
孔径为 0.2 μm的聚醚砜膜（ Filtropur ，SARSTEDT AG & Co. KG，目录号：83.1826.001）
容量为 15 mL 和 50 mL 的聚丙烯管（例如，Falcon 管，SARSTEDT AG & Co. KG，目录号：62.554.502 和 62.547.254）
圆底玻璃管（16×150 mm， Carl Roth，目录号：NY90.1）
磁棒 ROTILABO ® Micro （直径 2 毫米，长度 5 毫米，Carl Roth，目录号：0955.2）
注射器过滤器， Filtropur S，膜：聚醚砜(PES)，过滤表面：6.2 cm 2 ，孔径：0.2 µm，用于无菌过滤（ Sarstedt ，目录号： 83.1826.001）
注射器无菌二甲基亚砜（DMSO；Thermo Scientific，目录号 036480.AP）
1,2-二油酰- sn -甘油磷脂酰胆碱（DOPC；Avanti Polar Lipids，目录号：850375C）
铝箔_
钙黄绿素（Merck，目录号： 1461-15-0 ）
氯化钙（ Grüssing ，目录号： 102331000U ）
氯仿，乙醇稳定并证明不存在光气和 HCl（VWR，目录号：22711.290）
去离子水
HEPES（Carl Roth，目录号：6763.3）
液氮
甲醇（VWR，目录号：20834.291）
N 2气体（ALPHAGAZ 1 N 2，99.999 % ，Air Liquide，德国）
氯化钾（ Sigma-Aldrich ，目录号： 7447-40-7）
氢氧化钾（Fisher Scientific，目录号：P250-1）
Sephadex TM G-50 精细（GE Healthcare Bio-Sciences AB，目录号：17-0042-01）
Triton X® -100 ，超纯（Carl Roth，目录号：3051.3）
4-Br-A23187（Cfm Oskar Tropitzsch ， Marktredwitz ，目录号：76455-48-6）
缓冲液 A (200 mL)（参见配方）
钙黄绿素储备液（16.6 mM，1 mL）（参见配方）
CuCl 2原液 (2 mM)（参见食谱）
缓冲液 A 中的 G50-Gel（参见配方）
HEPES，pH 7.4（0.5 M，200 mL）（参见配方）
离子载体原液 (6 mM)（参见食谱）
KCl （0.5 M，200 mL）（参见配方）
KOH (1 M)（见食谱）
氯仿中的脂质原液（参见食谱）
上样缓冲液 (1 mL)（参见配方）
Triton X-100 溶液（20% w/v）（参见配方）

设备

镊子（例如，VWR，目录号：232-0032）
分析天平（例如，Sartorius Entris -I II，220 g/0.1 mg；Buch Holm，目录号：4669128）
用于 15 mL 聚丙烯管（例如， Eppendorf 5810 R)
适用于有机溶剂的流动柜
带有集成FelixGX软件的荧光计（PTI QuantaMaster 800 荧光计），配备单个比色皿 Peltier K-155-C 温度控制和磁力搅拌器（Horiba）
冰柜 (-20 °C)
10 µL、100 µL、250 µL、500 µL 和 1,000 µL 的 Hamilton 700 系列注射器（Hamilton ®注射器，700 和 1000 系列）
大型聚苯乙烯比色皿（德国 SARSTEDT AG & Co. KG，最大 4.5 mL 体积，目录号： 67.745 ）
磁铁 5 × 2毫米（默克，目录号：Z328839）
小型挤出机套件（Avanti Inc.，目录号：610023）
1 mL气密注射器（Avanti 编号：610017）
10 毫米过滤器支架（Avanti 编号：610014）
19 mm Nucleopore tracketch膜，孔径为 0.2 μm ( Schleicher & Schuell )
pH 计（pH 计 761 Calimatic，Knick）
移液器 P20、P200、P1000（GILSON® ，目录号：FD10001、FD10005 和 FD10006）
移液器吸头 2 µL、20 µL、200 µL 和 1,000 µL（SARSTEDT AG & Co. KG，目录号：70.1130.212、70.3021、70.760.002 和 70.3050.020）
冰箱 (4 °C)
剪刀
旋转蒸发器® 配备 I-100 控制器和 V-100 真空泵的 R-100 蒸发器（瑞士弗拉维尔）
Vortexer（Vortex Genie 2 TM ，BENDER & HOBEIN AG，瑞士）
水浴（例如，WPE45 Memmert ，德国）

软件

用于控制 PTI QuantaMaster 8000 荧光计和附件的FelixGX软件
适用于 Microsoft 365 MSO 的 Microsoft Excel（版本 2205）

程序

脂质膜的制备
清洁 Hamilton 注射器在通风橱下用氯仿:甲醇（1:1，体积/体积）冲洗五次。
笔记：氯仿是一种危险溶剂。在通风橱中进行所有工作，同时穿戴适当的个人防护设备。
使用 Hamilton 注射器，将 200 μL 的 25 mg mL -1 DOPC 库存溶液（参见配方 9 ）转移到放置在冰上的圆底玻璃管中。
处理有机溶剂时避免使用任何塑料制品。
在室温 (RT) 下在旋转蒸发器中在 250 mbar 的减压下蒸发有机溶剂过夜，然后在~ 10 mbar 蒸发 15 分钟，参见图1 。
干燥的脂质膜可以储存在-20°C 。

图1 。脂质膜制备方案。
(A) 将氯仿中所需量的脂质 (I) 转移到玻璃管中。随后，溶剂在旋转蒸发仪中在 250 mbar 的减压下蒸发过夜 (ON)，得到薄的脂质膜在玻璃管 (II) 的侧面。 (B) 在氯仿中含有所需脂质的玻璃管连接到旋转蒸发器。

钙黄绿素的LUV的制备
中加入 1 mL 的加载缓冲液（参见配方 10 ）和 3 毫米玻璃珠。涡旋 10 分钟（参见图 2A）。
将脂质悬浮液转移到没有玻璃珠的新玻璃管中。
通过将管交替放入液氮中 10 分钟进行冷冻，并在 50°C 的水浴中进行 5 分钟进行解冻，使脂质悬浮液经受五次冻融循环。
注意：处理液氮时戴上面罩和绝缘手套。使用具有高抗热震性的玻璃管。
组装微型挤出机，包括两个汉密尔顿玻璃注射器、一个带两个排水盘的聚四氟乙烯圆筒，以及它们之间的 200 nm 聚碳酸酯膜，参见图 2 B。
注意：我们通常使用 200 nm 孔径的聚碳酸酯膜，并在 RT 下进行挤压。然而，对于含有高脂相变温度 (T m )的饱和长链脂肪酸的脂类，挤出机需要加热到 5 – 10 °C高于 T m 。该温度在脂质制剂之间可能有很大差异。制造商在https://avantilipids.com/tech-support/physical-properties/phase-transition-temps/提供了有用的脂质相变温度表。
通过用 1 mL 缓冲液 A 冲洗检查微型挤出机的密封性（参见配方 1 ），即在注射器之间来回传递三到四次。仅当每次通过的缓冲量保持相同时才继续。
钙黄绿素填充一个 Hamilton 玻璃注射器溶液，并将填充的注射器放入微型挤出机的一端。
小心地将空注射器放入微型挤出机的另一端。空注射器的柱塞应完全压入注射器筒中。
通过过滤器挤出脂质悬浮液至少 11 次，从注射器 1 开始，在注射器 2 中结束。
注意：通过挤出机的通道数需要不均匀，以便将最终的脂质体样品收集在注射器 2 中，注射器 2 不会被从未通过挤出机的残留多层囊泡污染。
将最终的脂质溶液注入 1.5 mL 微量离心管中，并将其储存在 4°C。
注意：所得脂质体制剂的尺寸分布可以通过动态光散射进行评估。当使用孔径为 200 nm 的聚碳酸酯膜时，我们通常会获得流体动力学直径在 168.5 ± 2.5 nm 范围内的制剂。
立即用 Milli-Q 水清洗挤出机的所有部件，然后用 70% 乙醇清洗，并在储存前彻底干燥。储存前用溶剂冲洗注射器。挤出额外的囊泡时，拆开并清洗挤出机的所有部件，更换膜和过滤器支架。

图2 。加载钙黄绿素的LUV的制备方案。
(A) 干燥的脂质膜在含有荧光染料calcein (步骤 I) 的加载缓冲液中通过涡旋 10 分钟 (步骤 II) 进行水合。使用液氮（-196 °C，步骤 IV）和 50 °C 的水浴（步骤 V）对脂质悬浮液（步骤 III）进行五次冻融循环。接下来，将悬浮液通过安装在微型挤出机中的 0.2-μm 核孔聚碳酸酯膜 11 次以形成 LUV（步骤 VI）。 (B)微型挤出机的组装。使用四个过滤器支架，每侧两个。使用两个聚碳酸酯膜，空白面彼此相对。制造商网站 ( https://avantilipids.com/divisions/equipment-products/mini-extruder-assembly-instructions ; https://www.youtube.com/watch? v=WT6WPvGv5eY )。

中分离负载钙黄绿素的LUV
准备两根 G50 色谱柱，使用不带柱塞的 2 mL 塑料注射器，过滤器支架作为塞子，参见图3 A。
将注射器放入一次性 15-mL 反应管中，使用巴斯德吸管加入 3 mL Sephadex G50 细浆（参见配方 4 ），以 180 × g离心5 分钟，然后将色谱柱转移到新的 15-mL 反应管中.
将样品加载到 G50 柱之一的顶部。
在 180 × g和 RT 下离心 5 分钟（参见图3 B）。
将洗脱液转移到第二个 G50 柱的顶部。
再次以 180 × g离心和 RT 5 分钟（参见图3 C）。
如果您没有实现游离染料（柱的深黄色部分）与囊泡（柱的无色下部）的分离，请使用新的 G50 柱重复洗脱液的尺寸排阻层析。
收集含有钙黄绿素负载 LUV 的洗脱液。
用铝箔盖住管子。
注意：负载钙黄绿素的 LUV 可以在 4°C 的黑暗中储存到第二天。

图3 。通过尺寸排阻色谱法分离负载钙黄绿素的LUV。
(A) 对于尺寸排阻色谱法，将两个过滤器支架作为塞子放置在没有柱塞的 3 mL 塑料注射器中，并添加 3 mL 的 Sephadex G50 细浆。 (B)负载钙黄绿素的LUV在尺寸排阻层析期间与游离钙黄绿素分离。 LUV 将在早期分数中与空隙体积一起洗脱，而非脂质体相关钙黄绿素将在后期分数中洗脱。 (C) 图像显示在用捕获的游离钙黄绿素过滤后的 G50 过滤柱。第一次分离后，游离钙黄绿素位于第一个 G50 过滤柱中。下一次分离后，第二个 G50 过滤柱不含游离钙黄绿素。

监测离子渗透性
冷却缓冲液 A（参见配方1）、比色皿和加载钙黄绿素的LUV（例如，通过在 10 °C 的冰箱中储存）。
注意：为了在没有离子载体的情况下抑制未催化的转运速率，该测定在 10°C 下进行。其他脂质组合物的脂质体可能表现出较低的被动渗透性，因此允许较高的测定温度。
打开荧光计并设置如下参数：激发波长 480 nm，发射波长 520 nm，测量持续时间约为 10 分钟，分辨率为 1 秒。必要时调整狭缝； 3 nm 的带通通常就足够了。
将荧光计的样品架冷却至 10°C。
注意：我们使用基于 Peltier 的温度控制和磁力搅拌，在测量过程中提供温度稳定性和完整的控制软件。
比色皿中加入 20 µL钙黄绿素加载的LUV ，并使用预冷缓冲液补足至 2 mL。
为了探测离子载体对离子渗透性的影响，将 1 µL 离子载体（参见配方 6 ，终浓度 3 µM）加入比色皿中，并在冰箱中再孵育 5 分钟。
作为在离子存在下淬灭钙黄绿素的对照，通过将 10–20 µL 的 20% Triton X-100（参见配方 11 ）添加到比色皿中制备一个样品，并在冰箱中孵育 5 分钟。
将比色皿放入荧光计（记得包括磁力搅拌棒），并开始监测发射强度。
等到荧光稳定（90 秒）。
测量荧光强度。 1.5 分钟后，加入 3 µM CuCl 2 （3 µL 2 mM CuCl 2，参见配方 3 ），再记录荧光 8.5 分钟。
注意：为确保您的设置和加载钙黄绿素的LUV 正常工作，请在测量开始时运行 450 至 500 nm（发射 520 nm）的激发扫描和 500 至 550 nm（激发 480 nm）的发射扫描.对于钙黄绿素，激发和发射最大值应分别为 480 nm 和 520 nm（参见图 4）。

图4 。使用荧光计测量负载钙黄绿素的LUV 的激发和发射扫描。
在荧光计比色皿中，加入 20 µL 加载钙黄绿素的LUV，并使用预冷缓冲液 A 填充至 2 mL。在 450 – 500 nm（发射 520 nm，狭缝 3 nm）和发射扫描（灰色迹线）从 500 – 550 nm（激发 480 nm，狭缝 3 nm）。

数据分析

将测量数据保存为文本文档（txt 文件）。
将文本文档中的数据导出到 Microsoft Excel。
找到最大测量荧光信号 (Fmax)。
对于标准化，将测量的荧光信号除以 Fmax 并乘以 100（参见公式 1）。

Fnorm =F⁄Fmax*100 (1)

F：测量的荧光信号
Fmax：测量荧光信号的最大值
Fnorm ：归一化荧光信号

绘制Fnorm （参见图5 ）。
数据解释说明：在这种体外淬灭测定中，将离子载体（此处为 4-Br-A23187）插入 LUV 允许将 Cu 2+离子传输到囊泡中，然后淬灭封装的钙黄绿素荧光团（图 5）。在没有离子载体的情况下，荧光强度随时间呈线性下降，表明 Cu 2+离子缓慢渗透到囊泡中（图 5B，橙色迹线）。 4-Br-A23187 加速了 Cu 2+离子流入囊泡，如钙黄绿素荧光的快速猝灭所示（图 5B，蓝色曲线）。添加 Triton X-100 会破坏脂质体，从而作为 ~100% 淬火的控制（图 5B，灰色轨迹；图 5B，蓝色曲线）。

图 5. 离子载体 4-Br-A23187 的铜传输。
A) 基于加载钙黄绿素的 LUV 测量二价阳离子转运的测定示意图。二价阳离子转运到 LUV 会导致脂质体内钙黄绿素荧光随时间发生猝灭。 B)仅用 3 µM CuCl 2 （橙色迹线）或在 3 µM 4-Br-A23187（蓝色迹线）或 0.1% Triton X-100（灰色迹线）存在下处理加载钙黄绿素的 LUV 。存在离子载体时较高的离子渗透性导致比不存在离子载体时更快的钙黄绿素荧光猝灭速率（橙色迹线与蓝色迹线相比）。 Triton X-100 对脂质体的破坏使所有离子都可接近钙黄绿素，导致约100% 猝灭（灰色迹线）。将荧光强度归一化为添加铜之前的荧光。

笔记

所有数据均使用 Biorender.com 准备。

食谱

缓冲液 A（200 毫升）
将 4 mL 的 0.5 M HEPES pH 7.4（最终 10 mM）与 60 mL 的 0.5 M KCl （最终 150 mM）混合。
加入 100 mL 去离子水，用 KOH 将 pH 值调节至 7.4。
用去离子水补足至 200 mL 的最终体积，并用 0.22 μm 过滤器（Millipore）进行过滤消毒。
钙黄绿素原液（16.6 mM，1 mL）
10.334 mg钙黄绿素溶解到缓冲液 A 中 1 mL 的最终体积。
铝箔盖住管子以保护它免受日光照射。
CuCl 2库存 (2 毫米)
将 110.98 mg CuCl 2溶解在去离子水中，最终体积为 1 mL，以获得 1 M CuCl 2 。
然后，将 2 μL 的 1 M CuCl 2添加到 998 μL 的去离子水中。
缓冲液 A中的G50-Gel
将 2.5 g Sephadex G-50 添加到 50 mL 的缓冲液A 中，并通过混合溶解。
凝胶必须在 RT ON 膨胀，然后储存在 4 °C。
HEPES，pH 7.4（0.5 M，200 mL）
在去离子水中溶解 9.532 g HEPES 至 170 mL 的最终体积。
用 1 M KOH 将 pH 值调节至7.4，并用去离子水将其加至 200 mL。
离子载体原液 (6 mM)
在 1 mL DMSO 中制备 10 mg 4-Br-A23187 的初始库存。
为了达到 6 mM 1-Br-A23187，36.15 µL 储备溶液用 63.85 µL 过滤灭菌 DMSO 稀释，最终体积为 100 µL。
实验前，DMSO 使用 0.22-μm 注射器过滤系统进行过滤灭菌。
氯化钾（0.5 M，200 毫升）
溶解 7.455 g KCl至终体积 200 mL 在去离子水中。
氢氧化钾 (1 M)
将 5.611 克 KOH 溶解到最终体积为 100 mL 在去离子水中。
氯仿中的脂质储备
脂质在氯仿中以25 mg mL - 1的浓度排序，并储存在 -20 °C 直至进一步使用。为了更长时间的储存，蒸发氯仿并将干燥的脂质储存在-20°C。使用前，将 25 mg 脂质溶解在 1 mL 的氯仿：甲醇溶液 ( v:v ) 中。
氯仿：甲醇中的溶解度可能有限或非常差，需要氯仿：甲醇：水的混合物。
加载缓冲液 (1 毫升)
取 18.07 μL 的 16.6 mM钙黄素库存（最终 300 μM），并用缓冲液 A 加满至最终体积为 1 mL。用铝箔盖住管子。
Triton 100-X 溶液 (20% w/v)
将 200 mg 溶解在 1 mL 的去离子水中。

致谢

该协议改编自我们以前的工作(Senges et al. 2022).JEB 非常感谢德国研究基金会 (BA 4193/6-1, RTG 2341) 的资助。 HDU 是弗里德里希·艾伯特基金会的学者。

利益争夺

作者声明不存在相互竞争的利益。

参考

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