材料和试剂
电极植入材料
1. 镊子、手术刀柄、剪刀（ Stoelting ，目录号：5210883P、52171P、5210002P） 2. 26 针（Fisher Scientific，目录号：BD 305111） 3. 1 mL 注射器（Fisher Scientific，目录号：BD 309659） 4. 棉签涂抹器（Puritan，目录号：806 WC） 5. 毛刺钻尖（ Stoelting ，目录号：514552） 6. 手术夹（ Cellpoint Scientific，目录号：203-1000） 7. 手术缝合线，尺寸 5-0（Ethicon，目录号：J493G） 8. 牙科水泥（Co-Oralite MFG Co，目录号：525000） 9. 生物电势通道的 HD-X02 植入物[Data Sciences International (DSI)（Harvard Bioscience, Inc的部门）]，目录号：270-0172-001）试剂
10. 70% 乙醇 11. 洗必泰擦洗（ Mölnlycke ，目录号：0234-0575-08） 12. 0.9% 盐水溶液 13. 人工泪液软膏（ Aventix ，目录号：13585） 14. 美洛昔康（ Norbrook ，目录号：0342.90A） 15. Baytril （拜耳制药有限责任公司，目录号：AH039GH） 16. 5% Haemo-Sol 常规（Haemo-Sol，目录号： 026-050）

设备
脑电采集系统
1. Ponemah软件系统（DSI，目录号：PNM-P3P-CFG）包含在系统中：分析模块——脑电图分析软件模块（PNM-EEG100W）视频模块 – Noldus 媒体记录器 (PNM-VIDEO-008) Ponemah软件 6.51 (PNM-P3P-651) 新的Ponemah采集软件 (PNM-P3P-TELELV8) 分析模块——肌电图分析软件模块 (PNM-EMG100W) 计算机 – Lenovo ThinkPad T490 64 位 Windows 10 带扩展坞 (271-0112-031) 2. 小型企业路由器 – Cisco RV160 VPN 路由器（DSI，目录号：RV160） 3. 网络交换机 – 183w 网络交换机（DSI，目录号：271-0115-003） 4. MX2 – 带有用于信号接口支持的 USB 端口的 Matrix 2.0（DSI，目录号：271-0119-002） 5. RPC-1 – 带 4.5 m 电缆的塑料笼式接收器垫（DSI，目录号：272-6001-001） 6. Neuroscore软件（DSI，271-0165-CFG）包含在系统中： NS 3.3 核心 – Neuroscore v3.3 核心软件 (271-0165-330) 癫痫发作模块——Neuroscore癫痫发作模块 (271-0167-SEIZURE) 视频模块 – Neuroscore视频同步模块 (271-0168-VIDEO) 7. 摄像机 – 带有 Axis T8120 Midspan的 Axis M1145-L 网络摄像机套件（AXIS，目录号：275-0204-001）
计算硬件
该项目的主要目标之一是开发一种自主算法，该算法可以使用最少的计算能力快速处理大量 EEG 数据。为此，使用HP Spectre x360 笔记本电脑（制造商：HP，型号：15 -eb1043dx）处理所有 EEG 数据。使用的 CPU 是英特尔 i7-10510U，以 2.30 GHz 基本时钟速度运行，所有四个内核的最大时钟速度均为 4.30 GHz。总共 16 GB 的 GDDR4 显存以 2667 MHz 的频率运行。笔记本电脑有额外的 32 GB Intel Optane内存可用；然而，这在数据处理期间被禁用，因此在任何给定时间的最大可用内存为 16 GB。笔记本电脑包含Nvidia MX250 显卡；然而，由于 MATLAB 是一个 CPU 密集型程序，因此没有强烈考虑 GPU 处理能力。在使用标准 USB 2.0 硬盘驱动器时观察到处理时间增加后，EEG 数据写入内部 M.2 固态驱动器。
软件
1. Windows 10 操作系统（微软， https://www.microsoft.com/en-us/software-download/windows10 ） 2. Neuroscore，版本 3.3（Data Sciences International， https://www.datasci.com/products/software/neuroscore ） 3. Ponemah 软件 6.51 ( https://www.datasci.com/products/software/ponemah ) 4. MATLAB R2021a（MathWorks， https://www.mathworks.com/products/matlab.html ） 5. MATLAB 信号处理工具箱（MathWorks， https://www.mathworks.com/products/signal.html ）

程序
发作间期尖峰和惊厥发作分析的过程。有关电极植入和 EEG 采集程序的更多信息，我们引导读者阅读原始文章（ Puttachary等人，2015 年；Sharma 等人，2018 年和 2021 年）。
A. 手术准备和电极植入
使用 5% Haemo -Sol 溶液清洁手术设备 48-72小时，并在高压灭菌前在室温下干燥。在手术当天（电极植入），剃掉每只老鼠的头（在麻醉下），并用 70% 乙醇和洗必泰擦洗以洋葱壳图案清洁手术部位。手术前给予镇痛剂（美洛昔康，1-2 mg /kg，皮下）和眼膏。使用手术刀，在头部和颈部的中背侧做一个小的中线切口。通过使用钝性解剖在皮肤和筋膜之间建立隧道，将发射器插入侧面区域。然后，在每个半球的头骨上钻双边孔，并将电极硬膜外放置到大脑半球中。使用牙科水泥完全覆盖并固定电极。使用无菌手术缝合线关闭切口（ Puttachary等人，2015 年；Sharma 等人，2018 年和 2021 年）。提供了电极植入协议的视频（视频 1）。

视频1. 小鼠电极植入程序
B. 脑电图采集和设置
PhysioTel TM无线电遥测设备（发射器）使用由电压控制的振荡器，将生物电势转换为高频信号。所有PhysioTel TM HD无线电遥测设备都配有序列号。一旦打开，这些设备就会向接收器垫发送信号，接收器垫记录来自植入设备的序列号。然后将这些高频信号传输到数据交换矩阵，将输出信号转发到计算机。八个接收器垫可以连接到单个数据交换矩阵，并且可以通过Ponemah软件 6.51同时监控多个视频同步脑电图轨迹，采样频率为 1000 Hz。有关接收器垫、动物识别号、发射器序列号、数据矩阵中的插孔位置、信号强度和发射器信息（例如 EEG 和温度校准）的所有信息都记录到采集窗口中硬件设置下的每个矩阵中。 Ponemah采集软件以 1000 Hz 的采样率、100 Hz 的滤波器截止频率和 10 mV 的满量程采集 EEG 信号。遥测发射器的频率范围为 1–100 Hz。在发射器植入后不久，开始脑电图记录以获得每只动物的基线活动轨迹。每天可以同时从八只动物收集大约 5 GB 的视频（20 帧/秒）和脑电图数据（ Puttachary等人，2015 年；Sharma 等人，2018 年）。数据采集完成后，将 EEG 数据导出为 EDF 文件，以便在 MATLAB 中使用。
C. MATLAB 和工具箱的安装
可以从Windows、Linux 和 Macintosh 操作系统 (OS) 的MathWorks产品网页安装 MATLAB。出于我们的目的，使用了 Windows 操作系统，以下说明适用于在 Windows 64 位操作系统上安装 MATLAB。但是，有关在 Linux 操作系统上安装 MATLAB 的更多信息，请参见注释部分。首先，创建一个MathWorks帐户并导航至https://www.mathworks.com/products/matlab.html以查看可用产品。选择您要下载的 MATLAB 版本，然后单击“Windows 版下载”。下载后双击打开安装文件。出现提示时登录您的MathWorks帐户，然后按照屏幕上的说明完成安装。在安装过程中，选择MathWorks Signal Processing Toolbox 并在出现提示时安装补充软件包，以选择附加应用程序。
D. 手动脑电图分析
Neuroscore手动检测电图峰值和癫痫发作 3.3 软件，可从 DSI 购买。使用“脉冲序列协议”分析尖峰，该协议使用动态和绝对阈值识别癫痫样尖峰和尖峰持续时间。动态阈值允许用户根据分析时间点前大约一分钟的 EEG 信号均方根值的乘积来定义阈值，而绝对阈值允许用户定义固定幅度阈值（电压) 应用于正负两个方向。动态阈值包括阈值比率以及癫痫样尖峰检测标准的最大和最小比率，可防止在低噪声设置中检测到误报。绝对阈值包括 EEG 尖峰的最小和最大振幅，保持在 200 和 1,500 μV之间。因此，所有高于 200 μV的尖峰均被视为癫痫样尖峰。这些参数被指定用于从原始 EEG 数据中提取癫痫样尖峰。这些参数还考虑尖峰之间的最小和最大时间间隔，用于确定尖峰序列的可能成员。最后，脉冲序列的持续时间也用于从背景噪声中过滤出真正的癫痫样活动。设置完成后，通过 EDF 文件加载原始 EEG 数据，并指定所需的信号（功率带和活动计数）。完成后，可以分析原始 EEG 文件（ Puttachary等人，2015 年）。间期尖峰和癫痫发作根据脑电图尖峰特征（例如振幅、尖峰间间隔、持续时间和功率谱分析）进行区分。手动删除与鼠标行为（探索和修饰）和电气伪影相关的 EEG 信号，因此它们不会干扰分析。这些行为活动可以通过视频脑电图记录来验证 ( Tse et al., 2014; Puttachary et al., 2015)。对于癫痫发作分析，我们将惊厥发作 (CS) 的持续时间设置为 >10 秒。 CS 发作可持续 10-120秒，峰值间隔为 100-300毫秒。尖峰振幅通常在 500-1500 μV之间变化，在一个事件中尖峰频率/分钟为180-720 （ Puttachary等人，2015）。此外，已知功率带谱是检测癫痫发作的可靠措施（ Puttachary等人，2015 年；Sharma 等人，2018 年）。功率谱随癫痫发作的类型而变化，并且频谱在特定阶段的癫痫发作中经常发生变化（ Tse等人，2014 年； Puttachary等人，2015 年）。
E. 基于算法的（自动化）脑电图分析
1. 文件路径和数据导入（Block 1） MATLAB EEG 算法使用三组代码块进行编程。该算法的第一个块建立工作文件夹的文件路径，并使用edfread函数导入该文件夹中存在的所有 EDF 文件。这允许用户使用单个按钮单击来提取每个 EDF 文件。导入后，来自 EDF 文件的 EEG 数据将存储在元胞数组中，使用默认单位秒和微伏 ( μV )。然后，该算法将 EEG 振幅值转换为毫伏 (mV)。然后，记录日期被转换为日期数字格式，而时间值从频率值转换为以秒为单位的整数。 2. 基线 EEG 活动测定（第 2 块）间期尖峰和惊厥发作的位置。首先，该算法通过“running while”循环计算基线 EEG 活动值。这是通过从设置的最小值 100 μV以 5 μV的增量进行迭代，直到数据的第一个小时内 97% 的基线 EEG 数据点小于当前迭代的值。一旦满足此条件，算法将保存当前振幅迭代，将屏幕上的值输出给用户，并继续计算尖峰阈值上限和下限。用于确定基线活动的时间窗口（默认 ~ 1 小时）可以很容易地从 1 小时更改为适合用户的任何值，只要它短于 EEG 跟踪的总长度。此修改允许用户分析长度小于 1 小时的脑电图轨迹，并提供机会通过将时间窗口扩展到 1 小时以上（如果需要）来实现更准确的基线。 3. 阈值下限和阈值上限确定（Block 2）算法中包含的较低阈值变量是真正的发作间期尖峰与背景 EEG 噪声和正常基线活动的区别值。相关文献表明，两倍于基线活动值的较低阈值通常足以将真正的发作间期活动与基线 EEG 信号区分开来（ Anjum等人，2018）。如前一节所述，在确定基线 EEG 活动后，该算法通过将基线活动值加倍来计算发作间期分化的下限阈值。因此，间期尖峰的下限阈值不是固定的，而是取决于每个单独的 EEG 跟踪的基线活动值。发作间期尖峰的上限阈值也是预先指定的，以区分真正的发作间期尖峰与背景电噪声或动物运动。正如文献中报道的那样，1500 μV的上限阈值通常可以准确捕捉真正的发作间期活动，同时消除由于噪声和动物行为引起的 EEG 伪影（ Tse等人，2014 年； Puttachary等人，2015 年；Casillas-Espinosa 等人., 2019).对于每个 EEG 轨迹，上限阈值是固定的，但可以根据需要轻松调整。 4. 发作间期尖峰检测（Block 2）在确定这些关键参数之后，第二个代码块的其余部分检测发作间期尖峰和惊厥发作。该算法使用作为MathWorks信号处理工具箱一部分的findpeaks函数以及用于阐明发作间期活动的各种相关输入参数来检测 EEG 尖峰。发作间期尖峰之间的最小距离MinPeakDistance设置为 100毫秒的值，以确保多尖峰和其他异常尖峰模式不计为多个尖峰（ Puttachary等人，2015）。最小峰值突出度MinPeakProminence更好地描述为相对峰值振幅，设置为 200 μV的值，这也用于减少多尖峰和异常活动的检测，例如梳理和鼠标移动。最小峰值振幅MinPeakHeight指定为较低的阈值，以确保只有两倍于基线活动值的尖峰才被计为发作间期尖峰。最后，指定最大峰宽MaxPeakWidth为 200毫秒，以减少异常尖峰和 EEG 伪影的量化。与其他量化参数一样，所有这些值都可以轻松修改以过滤正在分析的 EEG 轨迹。完成发作间期尖峰检测后，该算法会记录满足所有预先指定约束条件的每个发作间期尖峰的日期、时间和振幅，并提供生成屏幕图形的选项，如图1所示。然后，该算法从进一步量化中删除任何未能满足所有指定标准（表 1 ）的尖峰。
图 1.使用自动算法确定的发作间期尖峰的代表性示例。 (A) MATLAB 生成的输出显示发作间期活动检测（红色圆圈标记的正负尖峰）。蓝色水平线代表自动确定的基线活动值，红色水平线代表较低的阈值（2X 基线活动）。 (B)单个发作间期尖峰的放大图像。
表格1。确定用于算法分析的发作间期尖峰存在的标准发作间期棘波分类标准较低的检测阈值 2 倍基线活动值上检测阈值 ≤1500微伏最小峰日珥 ≥200微伏最大峰宽 200毫秒峰值间隔 ≥100毫秒
5. 惊厥发作检测（第 2 块）上一节中描述的发作间期尖峰量化过程之后的脑电图轨迹。惊厥发作定义为具有高振幅频率放电的电图发作，持续至少 10 秒（ Guo et al., 2013; Goodrich et al, 2013），具有基线活动值的三倍，并且尖峰间隔为少于 5 秒（ Puttachary等人，2015 年）。量化惊厥发作的标准基于已发表的文献，量化尖峰簇和分组发作活动以评估癫痫发生（ Tse等人，2014 年； Puttachary等人，2015 年； Anjum等人，2018 年；Casillas-Espinosa 等人., 2019).首先，该算法使用上一节代码中的数据计算相邻电图尖峰之间经过的时间。然后该算法确定尖峰活动簇的起点和终点。任何大于预先指定的5 秒间发作间隔的间隔都将打破尖峰活动链，并自动重新开始下一个活动集群的量化。完成后，代码会处理每个尖峰簇并移除任何不符合预定义惊厥发作标准的簇（表 2 ）。如果满足所有条件，该算法将存储这些发作活动集群以及集群内相应的日期、发作时间、持续时间和发作尖峰数，可以绘制这些数据以进行屏幕分析（图 2）。

表 2. 在算法分析期间确定是否存在惊厥发作的标准惊厥发作分类标准最小峰值幅度 3 倍基线活动值最大尖峰振幅 ≤1500微伏最短发作持续时间 >10 秒最大尖峰间隔 <5 秒

图 2。 MATLAB 中尖峰和癫痫检测的可视化表示。 (A)显示受伤后第 21 天发作间期事件和癫痫发作的 EEG 轨迹片段。在同一天在一只小鼠中观察到三次自发性癫痫发作（以标有三角形的矩形块显示）。 (B) “A”中一次癫痫发作的扩展脑电图痕迹。 (C)增加的 EMG 活动显示在癫痫发作痕迹下方。 (D) C 中显示的癫痫发作的 EEG 轨迹进一步扩展。缩写：IIE，发作间期事件； EEG，脑电图；肌电图，肌电图； SRS，自发性反复发作。
6. 数据处理和导出（块 3）第三个也是最后一个代码块负责终端数据处理，并将编译后的数据导出到 Microsoft Excel，以进行进一步的数据操作或比较。首先，有绘制数据的说明，因此如果需要，可以在屏幕上查看数据。为了减少计算工作量并节省时间，默认情况下会抑制绘图指令。然而，在代码的半自动版本中，绘图显示在屏幕上，允许用户手动查看每个发作间期尖峰和惊厥发作。其余代码创建单独的数据表，其中包含当前工作文件夹中存在的每个 EEG 文件的发作间期尖峰数据和惊厥发作数据。因此，当代码终止时，所有脑电图痕迹的发作间期尖峰计数和惊厥发作量化数据将写入单独的 Excel 文件并存储在当前文件夹中。这使用户能够快速处理多个脑电图轨迹，并随时可以使用数据进行进一步审查，或在 MATLAB 编程环境之外进行进一步分析。图 3提供了各种算法块和处理步骤的简化图形表示。

图 3.示意图概述了为检测发作间期尖峰和惊厥发作而创建的自主 MATLAB 算法的处理步骤。算法的块 1 专门用于数据导入和单位转换。块 2 包含使用以红色突出显示的包含标准量化发作间期尖峰和惊厥发作的逻辑语句。区块 3 负责最终确定数据、绘制图形并导出最终的峰值和扣押数据。

数据分析
为了验证该算法的能力，将自动算法分析的发作间期尖峰计数和惊厥发作计数与基于视觉的Neuroscore量化（称为“手动”分析）进行了头对头比较。两种定量方法都使用了相同的阈值和尖峰检测参数。在三天内使用八只小鼠计算平均发作间期尖峰计数。总共分析了大约 170 小时的 EEG 数据并将其用于此比较。使用自动算法时，发作间期峰值计数平均比手动量化高 1.5%，标准差为 4.7%。表 3概述了每只动物的发作间期尖峰检测数据，以及使用 MATLAB 进行算法分析与使用NeuroScore进行手动分析的检测率。对于比率小于 1.00 的动物 S22 和 S24，重要的是要强调间期尖峰检测的下限阈值是基于简短的目视检查，而不是定义的标准。也就是说，虽然低于 1.00，但 MATLAB 分析提供了比通过目测随机分配更一致和可靠的分析。表3。 MATLAB 和NeuroScore量化的发作间期尖峰计数，以及 MATLAB 与NeuroScore计数的比率表明，在使用自动算法时，大多数动物的发作间期尖峰检测准确性有所提高老鼠 MATLAB发作间期尖峰神经评分发作间期尖峰比率 S20 6344 6174 1.0275 S21 2756 2703 1.0196 S22 1688 1813 0.9311 S23 5435 5373 1.0115 S24 729 776 0.9394 S25 16482 16130 1.0218 S26 6676 6327 1.0552 S27 7624 7286 1.0464
在自动量化之后，所有八只小鼠的发作间期尖峰计数都在 MATLAB 工作区内进行了手动验证，以确保不将无关的 EEG 活动量化为真正的发作间期活动。手动验证确认该算法成功识别了真正的发作间期活动，并且没有量化非发作间期事件或无关的 EEG 活动，例如正常的鼠标移动。因此，这些结果表明，与使用NeuroScore软件的基于视觉的手动量化相比，自主 MATLAB 算法具有几乎相同的发作间期尖峰检测能力，甚至更高。还使用自主算法对惊厥发作检测进行了量化。手动量化容易出错，即涉及大量的用户错误，并且这个问题阻碍了平均值和标准偏差的计算。然而，自主 MATLAB 算法能够准确识别在NeuroScore上手动记录的所有惊厥发作。此外，该算法能够识别在基于视觉的量化过程中遗漏的大量惊厥发作，从而大大减少与手动数据分析相关的人为错误。再一次，在 MATLAB 工作区内手动检查所有惊厥发作，以确保所识别的事件实际上是符合我们预先指定标准的真实发作，而不是伪影。因此，该算法被确定为比手动的、基于视觉的量化方法具有更高的抽搐检测能力，后者错过了许多癫痫发作。我们最重要的发现是使用自动算法节省的时间。 NeuroScore中基于视觉的手动量化需要大约四个月的时间来完全分析八只动物在三个月的观察期内记录的脑电图数据。相比之下，基于 MATLAB 的自主算法能够在大约 60 分钟内量化所有三个月的数据。总之，将算法与手动分析进行比较，我们观察到算法完成 EEG 量化所需的时间减少了 2000 多倍。同时，与手动过程相比，自动化算法保持了较高的尖峰检测精度并显示出改进的癫痫检测。计算负载是使用 Windows 10 中的内置任务管理器程序评估的。CPU 负载在 4.3 GHz 的时钟速度下的平均利用率为 50%。最大内存利用率达到 8.7 GB 的峰值，但 5.0 GB 的 RAM 用于运行后台进程。因此，在主动运行时，该算法在数据分析期间最多使用 3.7 GB 的 RAM。集成 GPU 利用率达到 14%，但这种利用率是 MATLAB 生成屏幕文本和背景图形用户界面的结果，而不是数据处理和量化的结果。
笔记
这些分析的代码位于： https: //github.com/Jackson-Kyle-CCOM/Automated-EEG-Algorithm 。值得注意的是，通过阅读 MATLAB 程序中算法代码中留下的注释，可以轻松调整所有 EEG 分析参数。这允许用户定制算法以最接近他们自己的 EEG 数据。应该注意的是，尽管进行了适当的调整，但具有大量背景 EEG 活动和噪声的 EEG 数据可能会降低算法的可靠性。尽管此算法是在 Windows 操作系统 (OS) 上运行的 MATLAB 中开发的，但我们知道某些用户可能更喜欢在 Linux 操作系统上运行。 MATLAB 可用于基于 Linux 的系统， MathWorks提供了有关设置和操作的说明，网址为https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_env/start-matlab-on-linux-platforms.html 。安装程序后，可以使用matlabroot /bin/ matlab命令启动 MATLAB，并可以使用以下命令操作算法代码ssh local.foo.com matlab - nodisplay - nojvm < hello.m ，通过命令窗口.

致谢
这项工作得到了 NIH 5R01NS098590 和 UIDM/ Tross Family 对Alexander G. Bassuk博士的资助。作者还要感谢 Michael Rebagliati编辑手稿。

利益争夺
所有作者在本研究中没有任何可披露和声明的利益冲突。

伦理
所有动物实验均按照美国爱荷华大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的指导方针进行，并事先获得批准。

参考
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