材料和试剂

RapidGel（500ml）（Affymetrix，目录号：75848）
尿素（CO（NH 2）2）（Sigma-Aldrich，目录号：U6504）
四甲基乙二胺（TEMED，C 6 H 16 N 2）（Thermo Fisher Scientific，目录号：110-18-9）
APS /过硫酸铵（（NH 4）2 S 2 S 2 O 8）（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
甲酰胺（CH 3 NO）（Thermo Fisher Scientific，目录号：75-12-7）
DEPC /焦碳酸二乙酯（O（COOC H 2 H 5）2）（Sigma-Aldrich，目录号：D5758）
溴代酚蓝（C 19 H 10 BrB 4 O 5 S）（Sigma-Aldrich，目录号：B0126 ）
二甲苯Cyanol FF（C 25 H 27 N 2nd N 2 NaO 6 S sub 2）（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
探针DNA寡聚体
[γ-sup 32 P] -ATP，10Ci/mmol 2mCi/ml，250μCi（PerkinElmer，目录号：BLU002250UC）
Whatman 3 M纸（Whatman，目录号：3 MM Chr）
Microspin G-25柱（GE Healthcare，目录号：27-5325-01）
Hybond N +膜（Amersham，目录号：RPN303B）
Ficoll（Sigma-Aldrich，目录号：F4375）
柠檬酸钠
BSA
聚乙烯吡咯烷酮（Sigma-Aldrich，目录号：PVP360）
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201S）
10x PNK缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0201S）
Tris碱（Thermo Fisher Scientific，目录号：77-86-1）
硼酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：10043-35-3）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-1KG）
亚甲基蓝（Sigma-Aldrich，目录号：28514-100G）
乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
鲑精DNA（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15632-011）}

设备

台式离心机
UV交联剂（Strata接头，型号：1800）
恒压电源> 450 V
曝光盒/增强屏（Sigma-Aldrich，目录号：C5479-1EA）
杂交瓶
杂交炉
大凝胶盒（约20×40厘米）
电影开发商

程序

第一部分：通过变性凝胶分离tRNA

通过Trizol RNA提取试剂盒或通过Wei（2012）中描述的热酚法制备总RNA。优质RNA将具有1.8至2的OD比260/280比和1.8或更大的OD 260/230比。
在大凝胶盒（大约20×30厘米。迷你凝胶在我的实验中不能很好地工作）中制备10％丙烯酰胺-6M尿素变性凝胶。
在1×TBE缓冲液中以恒定450V预运行凝胶，直到凝胶加热至50℃（约1小时）。注意：我发现这是至关重要的。一个原因可能是将凝胶预先运行到这个温度可以帮助除去凝胶中过多的尿素，使得RNA可能通过。我通常连接一个温度计，以确保温度达到50℃。
RNA样品与2x与甲酰胺负载染料混合，并加热至70℃2分钟
关闭电源。使用注射器和针头用1x TBE冲洗孔，确保尿素被冲洗掉
加载RNA样品（25μg），并在恒定的450V下运行凝胶约2小时（溴酚蓝运行约12nt，cyanol运行约55nt）。
让凝胶冷却至室温，拆开凝胶组

第二部分：将tRNA转移至膜

测量凝胶并用干净的手套和剪刀（用DEPC水洗涤并高压灭菌）切割一块Hybond N +膜。将膜浸泡在1×TBE中，附着到凝胶上。浸泡2件高压灭菌的Whatman 3 M纸在1 TBE和夹层凝胶膜。
转移凝胶/膜/whaman纸夹层到半干式转移装置。使用无菌输送吸管挤出膜和凝胶之间的气泡
擦去凝胶边缘周围的多余液体，并在恒定的10 V下转移2.5小时
拆解凝胶和膜，浸泡膜在DEPC水中1分钟。将膜置于高压灭菌的滤纸上10分钟以干燥膜。
用UV交联剂（Strata Linker 1800）以1,200×100m Joles将RNA交联到膜上。大约需要2分钟。
用亚甲蓝RNA染色溶液染色1分钟。通过用DEPC水洗涤数次来脱色30秒。这是为了评估RNA转移的效率。如果转移不好，我建议重复上述程序，因为放射性物质参与后面的步骤。
将膜保存在DEPC水中用于Northern印迹

第三部分：探针的5'末端标记

为了检查新合成的tRNA，设计特异性针对pre-tRNA而不是成熟tRNA的DNA寡核苷酸，因为成熟RNA是非常丰富的。前tRNA将被加工成成熟tRNA。在该过程中，某些DNA序列将被切割。引物将被设计为与切割的DNA序列退火。例如，pre-tRNA Leu3探针是5'-CCAAACAACCACTTATTTGTTGA-3'。
准备5'端标记反应缓冲液，并用放射性ATP在37°C标记探针1小时（详见配方详细信息）。
通过旋转柱中的树脂制备微球蛋白G-25柱
扣下底部并松开帽，置于1.5ml Eppendorf管中，并以700xg旋转柱1分钟。温和的离心对于柱形成平滑的成角度的表面是至关重要的
将柱置于新的Eppendorf管中，并缓慢地将标记反应应用于树脂床的成角度表面的中心。请勿打扰树脂。
在700×g下旋转柱2分钟。废弃放射性废物中的色谱柱。
取出1微升的标记探针在0.5毫升eppendorf管，将管放入闪烁瓶和计数cpm。

第四部分：杂交

混合杂交缓冲液，并取20ml到50ml锥形管中。
将缓冲液在65℃水浴中加热至澄清。应在10分钟内清除。
转移10毫升到带有膜（钞票转移侧是证明的一面）的杂交瓶，并在杂交炉中在37℃轻轻旋转60分钟。
将剩余的10ml杂交在37℃下放置30分钟
加热100微升鲑鱼精子DNA在90℃下1分钟，加入剩余的10毫升杂交缓冲液。
将20μl标记的探针加入到10 ml杂交缓冲液中，并剧烈摇动
滗析杂交瓶中的缓冲液，并加入带有标记探针的新杂交缓冲液。在杂交烘箱中在37℃轻轻旋转过夜。
将预温热的洗涤缓冲液在水浴中37℃。
转移杂交缓冲液与探头到50毫升锥形管，并将其存储在-20°C。探针可在2周内重复使用2-3次，但自动放射性信号会减少
通过在42℃下在杂交炉中旋转30分钟，用50ml洗涤缓冲液洗涤膜
重复洗涤2次以上。
取出膜并用Saran包装包裹。
将膜置于带增感屏和胶片的曝光盒中，置于-80℃冰箱中
3天后开发电影。如果信号弱，暴露1周。

食谱

DEPC水
将1ml DEPC加入1L ddH 2 O 2中，混合并在室温下放置过夜。高压灭菌。
DEPC水中10x TBE
在800ml DEPC水中，加入108g Tris碱，55g硼酸，40ml 0.5M EDTA（pH 8.0）。
混合溶解并加入DEPC水至1L 高压灭菌。
10％丙烯酰胺-6M尿素变性凝胶
1. 将2.5ml 10×TBE，6.25ml快速凝胶（40％）和15g尿素混合，加热至50℃并混合溶解。
2. 加入DEPC水至25ml，然后通过0.45μM过滤器注射器过滤
3. 加入25微升TEMED和50微升25％APS，剧烈混合，并转移到大凝胶设置与适当的梳子。
2x甲酰胺负载染料
95％（v/v）甲酰胺的DEPC水溶液中，加入微量的溴酚蓝（0.01〜0.1％）和二甲苯Cyanol FF（0.01〜0.1％
亚甲蓝RNA染色溶液
将乙酸钠在水中溶解至0.3M，并用冰醋酸和NaOH调节至pH5.5。将0.02g亚甲基蓝溶解在100ml上述溶液中并过滤。

5'端标记反应缓冲液

2微升	10x PNK缓冲区（新鲜来自NEB）
30 pmol	探针DNA寡聚体
3.3微升	[γ-³² P] ATP
1微升	T4多核苷酸激酶10 U/ml

将DEPC H sub 2 O加到20μl
中在37℃孵育至少1小时。

20X SSC（1L）
NaCl 175g
柠檬酸钠88g
加入DEPC水至1L，高压釜
50x Denhardt's溶液（100ml）

Ficoll
1 g ;

聚吡咯烷酮
1克

BSA
1克

加入DEPC水至100ml以溶解，通过0.45μm过滤注射器过滤溶液。
杂交缓冲液（1 L）

250 ml
20x SSC

100 ml
Denhart试剂（50x）

10 ml
10％SDS（高压灭菌）

将DEPC水加入1 L，在4℃下保存
洗涤缓冲液（1 L）
100ml 20×SSC
10ml 10％SDS（高压灭菌）加入890ml DEPC水并在室温下储存

致谢

该协议衍生自以下论文：Wei等人（2009a）和Wei等人（2009b）及其中的相关参考文献。该工作由NIH授予R01-CA099004和R01-CA123391支持给Dr. X.F. Steven Zheng在Robert Wood Johnson医学院，新泽西州医学和牙科大学。

参考文献

Wei，Y.，Tsang，C.K。和Zheng，X.F。（2009a）。 TORC1调节RNA聚合酶III依赖性转录的机制。 EMBO J 28（15）：2220-2230
Wei，Y。和Zheng，X.F。（2009b）。 Sch9部分介导TORC1信号转导以控制核糖体RNA合成。 Cell Cycle 8（24）：4085-4090。
Wei，Y。（2012）。通过热苯酚用于Northern印迹的来自酵母的RNA的简单制备。生物方案 2（9）：e209。