材料和试剂

EasySep ^®"自己动手"选择工具包（STEMCELL Technologies，目录号：18098）
小鼠IgG1 P75 NTR 抗体（Abcam，目录号：ab8877）
在PBS（2ml，98ml PBS，10mM）中的2％胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F4135）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，目录号：00-3002）
将片剂溶解在100ml蒸馏的H 2 O中。缓冲液含有10mM磷酸盐，150mM氯化钠（pH 7.3-7.5）
10x胰蛋白酶溶液（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15090046）
低葡萄糖DMEM（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：21885025）
5％v/v FBS（Sigma-Aldrich，目录号：F4135）
2mM L-谷氨酰胺（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：25030024）
牛血清白蛋白Pathocyte（MP Biomedicals，目录号：810111）
牛胰胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I-5500）
人转铁蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：T-2252）
孕酮（Sigma-Aldrich，目录号：P-0130）
腐胺（Sigma-Aldrich，目录号：P7505）
（Sigma-Aldrich，目录号：T-2501）
硒（Sigma-Aldrich，目录号：S-1382）
3,3'，5-三碘-1-甲腺原氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T-2752）
FGF2（25ng/ml）（Peprotech，目录号：100-18B）
调蛋白β-1（50ng/ml）（R& D Systems，目录号：396-HB-050）
福斯克林（5×10 -7 M）（Sigma-Aldrich，目录号：F6886）
庆大霉素溶液（50mg/ml，以1ml/l使用）（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）
L15培养基（Leibovitz培养基）（Sigma-Aldrich，目录号：L1518）
1.33％胶原酶（MP Biomedicals UK，目录号：195109 I型）
塑料瓶（Sterilin）（Thermo Fisher Scientific，目录号：129A）
牛胰腺DNAse（Sigma-Aldrich，目录号：D4263）
牛血清白蛋白级分v（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
星形胶质细胞条件培养基（ACM;以1:5使用）ACM是从汇合的星形胶质细胞单层收集的新鲜无血清培养基（DMEM-BS）48小时（noble& Murray，1984; Alexander等人，/em>，2002）
聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P1274）
70％乙醇
10％v/v无血清DMEM-Bottenstein和Sato（DMEM-BS）（Bottenstein等人，1979）（参见Recipes）

设备

EasySep ^®磁铁目录（STEMCELL technologies，目录号：18000）
FACS管5ml聚苯乙烯圆底管（BD Biosciences，目录号：352058）
50ml离心管（BD Biosciences，目录号：352070）
40μm细胞过滤器（BD Biosciences，目录号：352340）
1.5ml聚丙烯微量离心管（Griener Bio-One GmbH，目录号：616201）
将聚-L-赖氨酸包被的（13.3μg/ml，MW-100,000）（Sigma-Aldrich，目录号：P1274），T25cm 2组织培养烧瓶（Greiner Bio-One GmbH，目录号： 690175）
Nunc无菌离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339651）
25cm 2烧瓶（Greiner Bio-One GmbH，目录号：690160）
40μm细胞滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352340）
37℃孵育器
塑料瓶（Thermo Fisher Scientific，Sterilin ，目录号：129A）
21号针（BD Biosciences，目录号：305167）<
23 G针（BD Biosciences，目录号：305143）<

程序

用聚-L-赖氨酸（PLL，MW〜100,000）涂覆组织培养瓶
在ddH 2 O中（例如在25℃下在6.25ml中稀释25mg）制备4mg/ml的pLL，使用0.22μm过滤器进行过滤灭菌并在-20℃下储存。使用时在dH 2 O中稀释1:300（终浓度为13.3μg/ml）。
按照EasySep ^®"Do-It-Yourself"选择试剂盒提供的方案，构成阳性选择抗体混合物。简单地说，将15μg（15μl）小鼠IgG1 P75 NTR 加入到1.5ml微量离心管中。将100μl组分A（试剂盒中提供）加入到小瓶中，混匀。加入100微升组分B（试剂盒中提供）到小瓶中，混匀。将小瓶盖紧并将其置于加湿的37℃培养箱中，在7％CO 2中过夜。第二天通过加入985ml PBS使小瓶达到1.0ml的最终体积。阳性选择抗体混合物现在可以使用。
通过首先在家庭办公室许可下斩首幼仔，从出生后的幼崽中解剖出嗅球。将头部背面朝上放在解剖板上，并用70％乙醇喷雾。使用无菌仪器使用弯曲剪刀从头部清除皮肤，并做一个大的圆形切割，以去除头骨，显露大脑和两个嗅球在鼻尖。使用弯曲的镊子轻轻地删除嗅球。在500ml含有50μg/ml庆大霉素的L15培养基中的7ml塑料瓶中，在1.33％胶原酶（MP Biomedicals UK，195109 I型）中酶解消化球茎。将组织混合物置于加湿的37℃培养箱中，在7％CO 2中15分钟以帮助解离。在解离后，加入稀释在L15中的含有0.04mg/ml牛胰腺DNAse和3.0mg/ml牛血清白蛋白级分v的DNA酶（500μl）储备液，以防止细胞结块，并且通过轻轻地和缓慢地通过携带21号针头，随后是23G针头。将细胞悬浮液转移到15ml Nunc无菌离心管中，并以1,200rpm（〜480x/min）旋转5分钟，并将平板细胞在OEC培养基中在25℃ cm 2烧瓶中，并且每周更换一半培养基两次。在培养1周后，使用胰蛋白酶从烧瓶中除去细胞。首先用2.0ml PBS洗涤单层，除去，然后加入1ml含有100μl胰蛋白酶（10x）的PBS，并允许细胞在培养箱中分离1-2分钟。加入1ml 2％FBS以中和胰蛋白酶，旋转细胞以产生未纯化的嗅球细胞混合物（Higginson和Barnett，2011）。
使用5ml 2％FBS，通过40μm细胞过滤器洗涤分离的细胞并在1,200rpm离心5分钟。
重悬细胞沉淀在100μl2％FBS，并将其转移到5ml FACS管
加入10微升的阳性选择鸡尾酒在步骤1中组装到细胞悬液。充分混合并在室温下孵育15分钟
混合EasySep ^®磁性纳米颗粒，确保它们在均匀悬浮液中，通过上下吹吸至少5次。不推荐涡旋。加入5微升的磁性纳米粒子并混匀。在室温下孵育10分钟。
通过加入2％FBS使细胞悬浮液达到2.5ml的总体积。通过轻轻吹打上下2-3次将细胞在试管中混合。将管（无帽）放入EasySep ^®磁体。搁置5分钟。
拿起磁铁，在一个连续的运动，倒转磁铁和管，倾吐上清部分。磁性标记的细胞将保留在管内，由磁场保持。使磁铁和管倒置2-3秒，然后返回到直立位置。不要摇动或弄脏可能留在管口上的任何液滴。
从磁铁中取出管，加入2.5 ml的2％FBS。混合细胞悬浮液，轻轻吹打上下2-3次。将管放回磁铁，再放置5分钟。
重复步骤7到9一次，在磁体中总共有4个5分钟的分离。
从磁铁取出管，并重悬在3毫升OEC培养基中的细胞
离心含有细胞的FACS管1,200rpm（〜480×g/g）5分钟，以沉淀现在纯化的OEC。
重悬在50μl新鲜的OEC培养基中的沉淀，并在PLL包被的T25cm 2组织培养瓶中的条中平板。允许细胞在37°C附加15分钟。将细胞铺在小条中，使细胞以高密度附着到烧瓶上，从而提高活力
用3ml OEC培养基进行扩增烧瓶，并在37℃，7％CO 2下孵育。我们使用7％CO 2，因为这是所有胶质细胞的一般方案，当在蛋白质的原始纯化在Mark Noble的教授的实验室中进行时（Barnett等人 1993）。
7天后，条带的细胞将汇合，并且可以通过标准胰蛋白酶消化收获OEC，并且填充以供进一步使用。
使用该系统OECs将是至少98-99％纯的任何污染的成纤维细胞或其他细胞（见下图，图1）。

图1. P75 ^NTR （绿色）阳性OEC（蓝色DAPI可视化核）的图像。

食谱

10％v/v无血清DMEM-Bottenstein和Sato（DMEM-BS）（Bottenstein等人，1979）
通过组合DMEM-45g/L葡萄糖并补充：
25μg/ml庆大霉素
0.0286％牛血清白蛋白Pathocyte
0.5μg/ml牛胰岛素
100μg/ml人转铁蛋白
0.2μM孕酮
0.10μM腐胺
0.45μMl-甲状腺素
0.224μM硒
0.49μM3,3'，5'-三碘-1-甲腺氨酸

致谢

该方案改编自Franceschini和Barnett（1996）和Higginson和Barnett，（2011）。这项工作由MRC资助。

参考文献

Alexander，C.L.，Fitzgerald，U.F.and Barnett，S.C。（2002）。鉴别促进嗅鞘细胞长期增殖和调节其抗原表型的生长因子< a>。 Glia 37（4）：349-364。
Barnett，S.C.，Hutchins，A.M.and Noble，M。（1993）。从嗅球上纯化嗅神经鞘细胞。 /em> 155（2）：337-350
Bottenstein，J.E。和Sato，G.H。（1979）。大鼠神经母细胞瘤细胞系在无血清补充培养基中的生长。 Proc Natl Acad Sci U S A 76（1）：514-517。
Franceschini，I.A。和Barnett，S.C。（1996）。低亲和力NGF受体和EN-CAM表达定义两种类型的嗅神经包裹共享共同谱系的细胞。 Dev Biol 173（1）：327-343。
Higginson，J.R。和Barnett，S.C。（2011）。嗅鞘细胞（OEC）的文化 - 一种独特的胶质细胞类型。 Exp Neurol 229（1）：2-9。
Noble，M。和Murray，K。（1984）。纯化星形胶质细胞促进双潜能胶质祖细胞的体外分裂。 EMBO J 3（10）：2243-2247。