材料和试剂

抗体
1. FITC缀合的抗CD3抗体（BD Biosciences，目录号：553058，克隆145-2C11）
2. PE偶联的抗CD19抗体（BD Biosciences，目录号：557399，克隆1D3）
3. FITC缀合的抗CD4抗体（BD Biosciences，目录号：557667，克隆RM4-5）
4. PE缀合的抗CD8抗体（BD Biosciences，目录号：561095，克隆53-6.7）
微珠
1. 抗CD43微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-049-801）
2. 抗CD90微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-376）
3. 抗CD4微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-049-201）
4. 抗CD8微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-112）
其他
1. 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.2）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10010-031）
2. 牛血清白蛋白（BSA）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15561-020）
3. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-100G）
4. 冰冷的分离缓冲液（见配方）

设备

剪刀和镊子
MiniMACS分离单元（Miltenyi Biotec，MiniMACS Separator，目录号：130-090-312）
分离柱（Miltenyi Biotec，分离柱，类型MS，目录号：130-042-201）
细胞过滤器（BD Biosciences，目录号：352360）
流式细胞仪（BD Biosciences，Coulter）
振动器

程序

通过用Mini-MACS系统进行磁性分离从脾细胞中纯化B细胞，总T细胞和/或单阳性CD4 +和CD8 + T细胞[Miltenyi ，1990]（ http://www.miltenyibiotec.com ）。该方案说明了如何管理程序。

图1.使用磁性MACS珠分离CD4 +细胞的实验策略的示意图。将细胞与CD4-，CD8-，CD90-和CD43-抗体缀合的磁珠孵育。将细胞悬浮液进行柱选择并置于磁性分离器中。弃去流通液。然后用分离吹扫洗涤柱以提高纯度，然后从磁性分离器中除去。使用柱塞将磁性标记的细胞从柱中冲出。

牺牲小鼠和隔离完整的脾。
将脾脏通过100-μm细胞过滤器，通过用镊子压碎并将细胞悬浮液收集在5ml PBS中来获得单细胞悬浮液。
用1x PBS&离心细胞（100×g，5分钟），然后将脾细胞重悬于80μl冰冷的分离缓冲液/10μL细胞中。从正常脾脏，你会得到约8 x 10 ⁷细胞。整体工作温度为室温。缓冲液应该是冰冷的
加入20μl等分的抗体结合的微珠/10 10个细胞在4-8℃下在振荡器中温育30分钟。不需要预洗。细胞的数量取决于动物。
使用以下微珠：用于阴性分离静止B细胞的抗CD43微珠，用于总T细胞的阳性分离的抗CD90微珠，抗CD4和抗CD8微珠，用于相应T细胞亚群的阳性分离。
通过放置5毫升1 x PBS在顶部洗涤柱。液体通过重力流过柱。然后吸取标记的细胞悬浮液在分离柱顶部，其已用分离缓冲液洗涤三次并置于MiniMACS分离单元中。将悬浮液通过色谱柱。
在CD43-B细胞的阴性选择的情况下，收集流出物作为B细胞级分，并分别用5ml PBS离心洗涤三次。
在CD90 +，CD4 +或CD8 + T细胞的阳性选择的情况下，弃去流出物并用500μl分离缓冲液洗涤柱两次。随后，从分离器中取出柱，并使用柱塞用1ml分离缓冲液洗涤磁性标记的细胞。
用与B细胞相同的培养基洗涤各自的T细胞级分三次，
使用流式细胞仪通过流式细胞术分析评估各种细胞级分的纯度。用异硫氰酸荧光素（FITC）结合的抗CD3（检测总T细胞的克隆145-2C11），藻红蛋白（PE）结合的抗CD19（克隆1D3以检测B细胞），FITC-结合的抗CD19- CD4（克隆RM4-5以检测CD4 + T细胞）和PE缀合的抗CD8（克隆53-6.7以检测CD8 + T细胞），并分析对于阳性细胞，按照标准程序

食谱

分离缓冲区
1×具有5mM EDTA和0.5％BSA的PBS

致谢

作者感谢德国研究基金会（DFG）和大学埃尔兰根 - 纽伦堡资助。我们感谢A. von Berg和L. Sologub出色的技术援助。

参考文献

Miltenyi，S.，Muller，W.，Weichel，W。和Radbruch，A。（1990）。使用MACS的高梯度磁性细胞分离 Cytometry 11 （2）：231-238