材料和试剂

大麦（Hordeum vulgare L.）植物，1周龄幼苗
白粉病菌，新鲜分生孢子作为接种物
苯并咪唑（Genview，目录号：51-17-2）
琼脂（日本，植物细胞培养试验）
CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
X-gluc（Inalco，目录号：1758-0600）
考马斯亮蓝R-250（Amresco，目录号：0472）
乙醇（北京化工厂）
甘油（北京化工厂）
甲醇（北京化工厂）
乳酸（北京化工）
质粒
记者DNA
（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：10016718）
Triton X-100（AMRESCO，目录号：0694）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S-4139）（参见Recipes）
GUS染色溶液（见配方）
解决方案（参见配方）
苯并咪唑板（见配方）
考马斯蓝溶液（见配方）

设备

PDS-1000/He输送系统（Bio-Rad Laboratones）
Macrocarrier（Bio-Rad Laboratones，目录号：1652335）
破裂片（900psi）（Bio-Rad Laboratones，目录号：1652328）
离心机（Eppendorf，目录号：5424）
荧光显微镜（Carl Zeiss，Axio Scope.A1）
pH计（Mettler Toledo，FE20K）
金微载体：直径1.0μm（Bio-Rad Laboratones，目录号：165-2263）

程序

准备
1. 用白粉菌孢子接种植物以制备接种物和母猪大麦种子，以提前一周生长用于轰击的植物。将植物在生长室中在具有70％相对湿度的16小时/8小时，20℃/18℃日/夜循环下生长。
2. 提前一天准备苯并咪唑板。
轰击
1. 切下初级叶，将它们放在苯并咪唑板上，近轴侧向上（图1），每个培养皿每个培养皿3-5个叶片（90mm），孵育至少4小时，然后拍摄。
  
  图1.显示具有用于轰击的大麦叶的苯并咪唑琼脂板的制备图。将5-6个大麦初级叶与1周龄大麦分离幼苗并肩并肩放在一起准备苯并咪唑琼脂板。
2. 准备金粒子（20张）：
  1. 在1.5ml管中称量9mg金颗粒。
  2. 加入1ml 70％乙醇，涡旋5分钟，沉积颗粒在台上15分钟
  3. 旋转2秒。（约2000rpm），弃去上清液
  4. 重复3次：加入1ml无菌H 2 O，涡旋2分钟，沉淀1分钟，旋转2秒。（约2000rpm），弃去上清液
  5. 加入1ml 50％甘油（在水中），涡旋（金颗粒可以在-20℃下储存2-3周）。
3. 涂覆金颗粒（使用50μl金颗粒溶液一次性）：
  1. 漩涡金颗粒至少5分钟。
  2. 混合等摩尔质粒和报告基因（例如 GUS或GFP报告基因），不要使用超过2μg的DNA，当体积小于5时，加入ddH 2 O μl。
  3. 等分50μl金颗粒到每个空管，然后加入DNA溶液
  4. 在涡旋的同时，加入：50μl2.5M CaCl 2缓冲液，然后20μl0.1M亚精胺，总共涡旋3分钟。
  5. 沉淀颗粒1分钟，旋转2秒。（2,000rpm），弃去上清液
  6. 加入140μl70％乙醇，涡旋，旋转2秒。（2,000rpm），弃去上清液
  7. 加入140μl100％乙醇，涡旋，旋转2秒。（2,000rpm），弃去上清液
  8. 加入15μl100％乙醇，涡旋，存储在冰上，直到使用。
4. Bombard，对于每个镜头重复以下步骤：
  1. 将大载体固定在大载体支架中，通过吸移悬浮颗粒，并将颗粒应用于大载体上。在长凳上干燥。
  2. 在100％（v/v）2-丙醇中浸渍破裂盘（900psi），随后将其置于破裂盘保持盖中，再加几滴2-丙醇。
  3. 在位置1（从顶部）（图2）将带有止动屏幕的宏载体支架插入止动屏支架中
    
    图2.显示PDS-1000/He输送系统的图片。显示的是分别为宏载波持有者和patridish持有者保留的位置1和3。
  4. 在叶片的位置3插入培养皿（图2）。
  5. 使用真空度高达27英寸汞柱，触发镜头
  6. 在培养皿上放置叶子，放在孵化器中。
    注意：我们把叶子放在碟子上并排放置，正面朝上（图1）。
5. （如果不需要真菌接种，则省略此步骤）
  在轰击后至少4小时接种白粉病菌
用于GFP指数评分
轰击后36-48小时使用荧光显微镜计数GFP表达细胞数注意：这里的细胞总数是GUS表达细胞上的相容性（吸尘器，间隔菌丝）和不相容（仅吸附）的总和。我们对所有五片叶进行评分，至少60个细胞得分。

用于真菌Haustorium指数评分
1. 真菌孢子接种后48小时用于GUS表达的染色叶：将叶子放入含有约8ml X-gluc染色溶液的15ml falcon管中，真空渗入5分钟3次，并在37℃下孵育过夜至24小时。
2. GUS染色后1天
  取出GUS染色溶液，加入约10ml脱色液，室温下保存至少2天。
3. 可用时间：
  真菌污渍：
  1. 转移到大体积的ddH 2 O 2保持1小时。
  2. 在考马斯溶液中染色几秒钟。
  3. 在水中洗两次。
  4. 在显微镜载玻片上在50％甘油中。一旦在幻灯片上，样品应该在几天内得分。
4. 分数相容（可见细胞内吸尘器，有时在叶表面上的次生菌丝）和不相容（仅真菌附着）相互作用细胞/GUS表达细胞的位点。

食谱

苯并咪唑板
1％琼脂在水中，含有85μM苯并咪唑（来自8.5mM水中的储备溶液，100x）注意：这些板的pH值为约6.5。不需要调节pH值。
亚精胺
0.1M溶液，1g溶液与67.8ddH 2 O混合，过滤灭菌。
等分并储存在-20°C（注意：它是非常吸湿和空气敏感，关闭，并立即回到冰箱完成后）。
2.5M CaCl 2水溶液，无菌滤液在室温下保存
GUS染色溶液
0.1M Na 2 HPO 4水溶液/NaH 2 PO 4水溶液（pH 7.0）
10mM Na-EDTA
5mM K 4 Fe [CN 6]
5mM K 3 Fe [CN 6]
0.1％Triton X-100（v/v） 20％甲醇（v/v） 1 g/L X-gluc
调整至pH7.0
脱色溶液：储液
50％甘油 25％乳酸
25％H 2 O * 将1体积储备溶液溶解在2体积乙醇中。
考马斯蓝溶液
0.6％考马斯蓝（w/v）在100％（v/v）甲醇/或乙醇中

致谢

该协议改编自Shirasu等人（1999）; Shen等人（2012）和Bai等人（2012）。

参考文献

Bai，S.，Liu，J.，Chang，C.，Zhang，L.，Maekawa，T.，Wang，Q.，Xiao，W.，Liu，Y.，Chai，J.，Takken，FL，Schulze -Lefert，P。和Shen，QH（2012）。大麦NLR免疫受体MLA10的结构功能分析揭示了其在细胞死亡和疾病中的细胞区室比活性 PLoS Pathog 8（6）：e1002752。
Shen，QH，Zhou，F.，Bieri， S.，Haizel，T.，Shirasu，K.and Schulze-Lefert，（2003）。大麦Mla病抗性基因对白粉病真菌的识别特异性和RAR1/SGT1依赖性。 a> 15（3）：732-744。
Shirasu，K.，Nielsen，K.，Piffanelli，P.，Oliver，R。，和Schulze-Lefert，P。（1999）。单元格自主互补 mlo 使用生物射弹瞬时表达系统的抗性。 Plant J 17：293-299