材料和试剂

蔗糖
HEPES
氯化钾（KCl）
氯化镁（MgCl 2）
乙二胺四乙酸（EDTA）
乙二醇四乙酸（EGTA）
二硫苏糖醇（DTT）
Tris（Affymetrix-USB，目录号：75825）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：13565）
Nonidet P40替代品（NP40）
脱氧胆酸钠
甘油
十二烷基硫酸钠（SDS）
蛋白酶抑制剂（PI）混合物（F.Hoffmann-La Roche，目录号：11836145001）
甲醇
乙酸
Brilliant Blue R（Affymetrix，目录号：32826）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
组蛋白H3抗体（Cell Signaling Technology，目录号：9715）
α-微管蛋白抗体（GeneTex，目录号：GTX108784）
细胞刮刀（BD Biosciences，Falcon，目录号：353086）
亚细胞分级缓冲液（SF缓冲液）（参见配方）
核裂解缓冲液（NL缓冲液）（参见配方）
Brilliant Blue R染色溶液和脱色溶液（参见配方）

设备

4℃微量离心机（Eppendorf，目录号：5415R）;
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima TLX）
可选：Sonicator（Sonics，型号：VC505）
Whatman滤纸
37℃孵育器
1.5 ml Eppendorf微管
管辊（Maplelab-scientific，型号：MTR-1D）

程序

注意：将样品在冰上保持在4°C！所有缓冲液在使用时必须是冰冷的。除非另有说明，所有离心均在Eppendorf Microcentrifuge中进行。

在100mm培养板上培养细胞，直到在5％CO 2提供的37℃培养箱中75％汇合。对于初学者，建议良好研究的HEK293及其衍生物易于维护和异位蛋白表达。
注意：这是为贴壁细胞。悬浮细胞可能需要在裂解前离心。
用冰冷的PBS洗涤两次，立即添加500微升每100毫米板的SF缓冲液，并放在冰上，使用细胞刮刀收集裂解液，并转移到1.5毫升的Eppendorf管。如果收集多个样品，一次处理一个样品。
在4℃下搅拌裂解物30分钟，在管辊上以约30-50rpm搅拌
在4℃下以720×g离心5分钟。小心转移上清液到一个新的1.5毫升管以备将来使用。保持沉淀物下一步。
用500μlSF缓冲液洗涤沉淀，用移液管分散沉淀。
在4℃下以720×g离心沉淀10分钟。
除去上清液，并在NL缓冲液中重悬沉淀。搅拌并在4℃孵育15分钟。
任选：在冰上超声处理沉淀（2×3秒超声处理，通过3秒静息，在30％全幅度功率下分离，在冰上！这是包括核膜的核部分。
将来自步骤4的上清液在4℃以10,000×g离心10分钟。
小心转移上清液到新的1.5 ml管。这是胞质和膜部分。
在超速离心机中离心步骤9的细胞溶质和膜级分。在4℃下以100,000xg超速离心1小时。小心转移上清液到新的1.5 ml管。这是胞质部分。
用500μlSF缓冲液洗涤沉淀，并通过吸移重悬。
在4℃下将所述沉淀以100,000xg超速离心1小时。
除去上清液并将沉淀重悬在NL缓冲液中。
任选：在冰上超声处理沉淀（与步骤7中的核级分相同的设置）。这是膜部分。
可以使用Western印迹的内部负荷控制来确保每个级分不会交叉污染其他级分;但是也可以在样品之间确定相对量以确保相等的负载。例如，α-微管蛋白用于胞质部分;组蛋白H3用于核部分;亮蓝R用于膜部分的染色。使用额外的凝胶装载控制。在将蛋白质转移到PVDF膜上之后探测α-微管蛋白和组蛋白H3。 Brilliant Blue R染色可直接用于SDS-PAGE凝胶（图1）。
注意：Brilliant Blue R在这里用于监测不同样品之间蛋白质负载的相对量，但不能显示交叉污染。膜蛋白例如EGF受体和整联蛋白可以用于证实膜和其它级分之间的交叉污染。然而，这些膜蛋白的回收可能是一个问题，这可能是假阳性的交叉污染。

图1.核，细胞质和膜级分的Western印迹具有内部对照。α-微管蛋白和组蛋白H3用于细胞质和核级分;辉煌蓝R 染色用于膜级分

食谱

亚细胞分级缓冲液（SF缓冲液）

	股票	50 ml 1x解决方案
250 mM蔗糖	-	4.28克
20mM HEPES（pH7.4）	1 M	1 ml
10 mM KCl	-	0.0373克
1.5mM MgCl 2·h/v	1 M	75微升
1mM EDTA	0.5 M	100微升
1 mM EGTA	0.5 M	100微升

使用时，将以下物质加入10ml SF缓冲液
中

	股票	10毫升1x解决方案
1 mM DTT	1 M	10微升
PI鸡尾酒	40x（在2ml dd H 2 O中溶解1片）	250微升

核裂解缓冲液（NL缓冲液）

	股票	50 ml 1x解决方案
50mM Tris HCl（pH8）	1 M	2.5 ml
150mM NaCl	1 M	7.5 ml
1％NP-40	20％	2.5 ml
0.5％脱氧胆酸钠	10％	2.5 ml
0.1％SDS	10％	0.5ml

使用时，将以下物质加入10ml NL缓冲液
中

股票
10ml 1x溶液

PI鸡尾酒
40x
250微升

10％甘油 -
1 ml

注意：如果需要进一步细致的实验，如IP和ChIP，可以添加DTT; 目前没有DTT的食谱适用于Western印迹。
Brilliant Blue R染色溶液和脱色溶液对于染色溶液，将1g亮蓝色粉末溶解在1L的50％甲醇/10％乙酸/40％H 2 O（全[v/v]）溶液中。搅拌直至溶解并（可选）通过Whatman滤纸过滤为了脱色，制备10％乙酸/15％甲醇/75％H 2 O溶液。
程序：将含有感兴趣的蛋白质的凝胶置于塑料容器中，并盖上新鲜的染色溶液。在室温下摇动1小时（或过夜）。取出染色溶液并加入脱色溶液。将三片细级棉纸放入容器中。摇动，直到凝胶完全脱色。不断更换溶液和薄纸。

致谢

该协议基于来自Abcam的Richard Patten博士（参见参考文献1），并在Huang等人（2012）的出版物中进行了修改和使用。

参考文献

Patten R. 使用离心方法分离核，细胞膜和细胞质细胞级分的程序。
Huang，Z.，Cheng，Y.，Chiu，P.M.，Cheung，F.M.，Nicholls，J.M.，Kwong，D.L.，Lee，A.W.，Zabarovsky，E.R.，Stanbridge，E.J.Lung，H.L.and Lung，肿瘤抑制基因Alpha B晶状体蛋白（CRYAB）与钙粘着蛋白/连环蛋白粘附连接相关，并损害NPC进展相关属性。 Oncogene 31（32）：3709-