材料和试剂

EZ-96 DNA甲基化试剂盒（Zymo Research，目录号：D5003）
乙醇（VWR International，目录号：20821.330）
基因组DNA
PCR级水（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：AM9937）
PCR试剂：PCR缓冲液，dNTPs，Taq（Roche Applied Science，目录号：04738420001）
用于甲基化特异性PCR的引物[参见步骤20-（1）]
96孔0.2ml微量培养板（Starlab，目录号：I1402-9800-C）
96孔0.8ml微量培养板（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB-0765）
密封片（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB-0558）
Infinium Human Methylation450 BeadChip Kit（Illumina，目录号：WG-314-1003）
PyroMark Q96 CpG LINE-1试剂盒（QIAGEN，目录号：973043）和相关试剂（可选）

设备

96孔热循环仪
用微孔板适配器离心
涡流搅拌器
HiScan SQ或iScan系统（Illumina，目录号：SY-103-2001或SY-101-1001）
GenomeStudio甲基化模块软件（Illumina，目录号：SW-300-1001）
NanoDrop ND-1000紫外 - 可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific）或等同物
速度真空（可选）
PyroMark Q96 MD（QIAGEN，目录号：9001526）或等同物（可选）

程序

使用NanoDrop定量基因组DNA浓度并确定A 260/280比率，其应该> 1.80用于待分析的样品。
将每个DNA样品在水中稀释至100ng /μl浓度。
注意：也可以使用较低浓度的样品，并且相应地调整步骤6中的体积以满足所需的最小DNA量。然而，在步骤6中使用的具有较低浓度的DNA样品的体积不应超过45μl的最大体积。
注意：一旦DNA被亚硫酸氢盐处理，应尽快用于Infinium甲基化分析，最好在一个月内。
通过向一瓶CT转化试剂中加入7.5 ml水和2.1 ml M-Dilution缓冲液，从EZ96 DNA甲基化试剂盒制备转化试剂。在室温下混合，经常涡旋10分钟，并保持试剂在黑暗中注意：看到痕量的未溶解的CT转换试剂是正常的。此外，为了获得最佳效果，试剂应在制备后立即使用。
通过加入144 ml 100％乙醇到36 ml M-Wash Buffer浓缩液中，从EZ96 DNA甲基化试剂盒制备M-Wash缓冲液。
吸取10μl的每个DNA样品（100ng /μl）到用于亚硫酸氢盐处理的96孔0.2ml微量培养板中（500ng是所使用的DNA的最小量）。
向每个样品中加入5μlM-Dilution缓冲液，用水调整总体积至50μl，并通过上下吹吸混匀。用密封片密封。
使用热循环仪在37℃孵育样品15分钟
向每个样品中加入100μl制备的CT转化试剂，并通过上下吹吸数次混合。密封板带密封片。
注意：CT-转化试剂含有97％的偏亚硫酸氢钠（亚硫酸氢根离子），其介导亚硫酸盐介导的未甲基化胞嘧啶的脱氨作用。
使用以下程序在热循环仪上孵育样品
1. 95℃30秒。
2. 50℃下1小时，并重复步骤a和b再进行15个循环。
3. 4℃10分钟。
从EZ96 DNA甲基化试剂盒，将硅A结合板放置在收集板的顶部，并移取400μlM-结合缓冲液到每个孔中。该缓冲液含有胍盐酸盐，其提供使DNA能够与二氧化硅颗粒结合并允许洗涤和亚硫酸氢盐处理DNA的pH。
将步骤10的DNA样品装入硅胶结合板的孔中，通过上下吹吸混合。
在室温下以≥3,000xg离心5分钟，弃去流出液。在此协议中的所有离心步骤中使用此条件。
向每个孔中加入500μlM-Wash缓冲液，并在≥3,000xg离心5分钟。丢弃流通。 M-洗涤缓冲液是从前面步骤中的二氧化硅结合的DNA洗涤和清洁任何试剂。
向每个孔中加入200μl的M-脱磺化缓冲液，并使其在室温下静置15-20分钟。在孵育后在≥3,000xg下离心5分钟。丢弃流通。 M-脱磺化缓冲液含有将脱氨胞嘧啶转化成尿嘧啶的氢氧化钠。
向每个孔中加入500μlM-Wash缓冲液，并在≥3,000xg离心5分钟。丢弃流出物。
向每个孔中再加入500μlM-Wash缓冲液，并在≥3,000xg离心10分钟。确保硅-A结合板的孔中没有液体，否则离心2分钟
将硅A结合板放在洗脱板上。
在硅A结合板的每个孔中向结合基质直接加入30μlM-洗脱缓冲液。在室温下孵育1-2分钟，在≥3,000xg离心3分钟以洗脱DNA。 M-洗脱缓冲液含有1％Tris（羟甲基）氨基甲烷/盐酸和1％乙二胺四乙酸，pH 8.0，使得DNA能够从二氧化硅柱上解离。
保留4μl每个（亚硫酸氢盐转换的）DNA样品用于质量控制，并在-20℃下将剩余量存储在洗脱板中。
注意：建议在转化后1个月内，在Infinium HumanMethylation450 BeadChip上使用经亚硫酸氢盐转换的样品，并避免样品反复冻融。
通过使用例如甲基化特异性PCR（Ku等人，2011）针对感兴趣的基因来评估亚硫酸氢盐转化的DNA的质量（参见下面关于我们的用于Calponin基因的甲基化特异性PCR的实例）或使用PyroMark Q96 CpG LINE-1试剂盒对LINE1进行焦磷酸测序。继续通过质量控制的DNA样品，即显示具有甲基化特异性PCR的PCR产物或通过亚硫酸氢盐的样品包含在LINE1焦磷酸测序测定中。
注意：
1）Calponin基因的甲基化特异性PCR，用于评估亚硫酸氢盐处理的DNA的质量：
   将15.8μl水与
混合     2.5μl     3μlMgCl 2（25mM）
    0.5μldNTP（2.5 mM）
    1μl正向引物（5'-GGAAGGTAGTTGAGGTTGTG-3'，20μM）
    1μl反向引物（5'-CCCAAACTCAAAACTCTAACCTAAC-3'，20μM）
    1μl亚硫酸氢盐转换的DNA
    0.2μlTaq（5 U）
2） PCR条件：
    a。 95℃6分钟
    b。 95℃30秒
    c。 63°C 30秒
    d。 72°C 30秒
   重复步骤b到d 35个周期
    72℃5分钟。
在2％琼脂糖凝胶上运行PCR产物以确认扩增子（333bp）的存在，其证实亚硫酸氢盐转化在各样品中成功。（Teodoridis et al。，2005）
使用NanoDrop确定亚硫酸氢盐处理的DNA的浓度。
注意：由于亚硫酸氢盐处理可以降解DNA样品，我们在我们的方案中在亚硫酸氢盐处理之后具有另外的DNA定量步骤，以确保在进行Infinium甲基化分析之前存在足够的样品。
解冻DNA样品储存在-20°C，并短暂离心。用M-洗脱缓冲液或水将每个样品的DNA浓度调节至50ng /μl。
注意：低于50 ngμl^-1的DNA样本可能会使用真空浓缩。
在Infinium HD Assay Methylation Protocol中将6μl的每个50 ngμl^{-1样品转移到一个新的0.8 ml 96孔微孔板中，该微孔板标记为BCD板。}
根据Infinium HD Assay Methylation Protocol Guide（参见参考文献3），从第43页的步骤3（在制备MSA4板的步骤）开始，处理4μl（或等价的200ng）样品。简言之，将亚硫酸氢盐转化的DNA全基因组扩增，片段化并与BeadChip杂交。杂交后，洗掉未杂交的DNA，使用标记的核苷酸和捕获的DNA作为模板扩增BeadChip上的探针。将BeadChip荧光染色，扫描并测量珠的强度。
在处理后，从扫描阵列提取DNA甲基化信号。
背景校正原始信号并使用GenomeStudio软件计算为β值
在进行数据分析之前，请使用GenomeStudio软件进行质量控制。可以通过检查探针的检测p值以及存在于珠粒芯片上的样品依赖性和样品非依赖性对照探针来评估数据质量。将以下标准应用于去除效能差的探针或样品：a）应该从分析中排除检测p值高于某一截止值（例如p <0.05）的探针， b）任何阵列控制探针中出现故障的样品，即样品的对照探针的原始信号强度超出所有样品的信号强度的正常范围（中位数+ 3SD或中位-3SD，取决于对照探针类型）样品和c）如果某个探针通过检测p值在大于10-25％的样品中的质量控制失败，那么该探针应当从进一步的下游分析中去除。
应该执行在阵列标准化之内和之间的适当方法。例如，Genome工作室软件提供内部对照归一化程序。
Infinium 450 K BeadChip使用两种不同类型的测定化学成分（Infinium I和Infinium II探针）。 β值表示甲基化珠类型的强度与组合的基因座强度（Infinium 1型探针）的比率或来自绿色通道（对应于甲基化的CpG态）的信号的强度与组合的从红色和绿色通道获得的强度（Infinium II型探针）并反映特定CpG位点的甲基化状态。由于导致不同β值分布的Infinium I和II探针的不同化学性质，推荐进行峰值碱基校正或探针的标度以更准确地反映I型和II型探针的发散分布。不同的峰基校正方法是公众可获得的;参见例如（Teschendorff等人，2013）。

致谢

这项工作是由癌症研究英国（C536/A6689），帝国实验癌症医学中心和英国癌症研究英国中心的资助奖励支持。

参考文献

Dedeurwaerder，S.，Defrance，M.，Calonne，E.，Denis，H.，Sotiriou，C.and Fuks，F。（2011）。评估Infinium甲基化450K技术。 3（6）：771-784。
EZ-96 DNA甲基化试剂盒D5003使用说明书版本1.2.6，Zymo研究
GenomeStudio Methylation Module v1.8用户指南，目录号＃11319130 Rev. B 2010年11月，Illumina。
Infinium HD Assay Methylation Protocol Guide，目录号：WG -914-1001Pat＃15019519 Rev. A December 2010，Illumina。
Ku，J.L.，Jeon，Y.K.，Park，J.G。（2011）。甲基化特异性PCR 。 Methods Mol Biol 791：23-32。
PyroMark Q96 CpG LINE-1 Handbook 12/2010，Qiagen
Sriraksa，R.，Chaopatchayakul，P.，Jearanaikoon，P.，Leelayuwat，C.and Limpaiboon，T.（2010）。使用Calponin特异性引物组验证完整的亚硫酸氢盐修饰。 43（4-5）：528-530。
Teschendorff，A.E.，Marabita，F.，Lechner，M.，Bartlett，T.，Tegner，J.，Gomez-Cabrero，D.，Beck，S。（2013）。用于校正Illumina infinium 450k DNA甲基化数据中的探针设计偏差的Beta混合分子标准化方法。/a> Bioinformatics 29（2）：189-196
Teodoridis，JM，Hall，J.，Marsh，S.，Kannall，HD，Smyth，C.，Curto，J.，Siddiqui，N.，Gabra，H.，McLeod，HL，Strathdee，。（2005）。晚期卵巢癌中DNA损伤应答基因的CpG岛甲基化。癌症Res 65（19）：8961-8967。
Touleimat，N。和Tost，J。（2012）。完成Infinium（（R））人甲基化450K BeadChip数据处理的管道，使用子集分位数归一化进行精确DNA甲基化估计 Epigenomics 4（3）：325-341。
Zeller，C.，Dai，W.，Steele，NL，Siddiq，A.，Walley，AJ，Wilhelm-Benartzi，CS，Rizzo，S.，van der Zee，A.，Plumb，JA和Brown， 2012）。候选DNA甲基化驱动因素，通过甲基化和表达谱分析确定的卵巢癌患者获得性顺铂耐药。 Oncogene 31（42）：4567-4576。