材料和试剂

氯仿，ACS级（Sigma-Aldrich，目录号：319988-4L）
N，O-双（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷（99:1BSTFA + TMCS）（Sigma-Aldrich，目录号：33148）
吡啶，ACS级（Thermo Fisher Scientific，目录号：P368-500）
二十四烷（固体，用作内标）（Sigma-Aldrich，目录号：87089-1G）

设备

尺寸或已知尺寸的标签
顶部透明片（仅用于叶蜡分析）
相机，理想情况下用小三脚架
剪刀
镊子
11ml玻璃管（Wheaton，目录号：358606）
1.5ml GC小瓶（Agilent，目录号：5182-0715）
250μlGC小瓶插入物（Agilent，目录号：5183-2085）
GC小瓶架
100μl玻璃注射器（Hamilton，目录号：80630）
500μl玻璃注射器（Hamilton，目录号：80865）
烤箱
使用Reacti-Therm加热模块（Thermo Fisher Scientific，目录号：TS-18822）的Reacti-Vap蒸发器（Thermo Fisher Scientific，目录号：TS-18825）
氮气（Praxair NI M-T）
Adobe Photoshop
Microsoft Excel
气相色谱系统
1. 带有FID的Agilent 7890A GC系统
2. HP1甲基硅氧烷柱（Agilent，19091Z-313）
3. 氢气（GC载气和FID燃料）和压缩空气（用于FID）

程序

注意：协议的几个步骤在叶和茎之间有所不同。氯仿，吡啶和BSTFA都应在通风橱中处理。

通过将500μg二十四烷溶解在500μl氯仿中制备1μgμl^{-1 内标。如果你希望经常分析蜡，扩大规模以制造大量库存，并在1.5 ml GC小瓶中等分已知量的原料。让氯仿蒸发掉，密封小瓶，并在4°C下保存。将氯仿中的等分试样重悬至其初始体积，以便立即使用。}
为您将收集的每个样品准备一个11毫升玻璃管。我们建议对您正在研究的每个基因型使用3-6个技术重复。开始之前，用氯仿冲洗所有玻璃管三次。然后，用约10ml氯仿填充管，并向每个样品加入10μl内标。至关重要的是，每次进行蜡分析实验时，记住包括一组野生型样品作为阳性对照。蜡的负荷和组成可以根据您的植物生长的条件大不相同，因此这种控制是必要的，以区分由不同基因型引起的变化与环境条件或收获时植物发育阶段的变化。如果您想单独检查溶剂和标准品的GC谱图，您可以在此步骤准备额外的试管，这样不会有组织样品浸入其中。
STEMS：用于表面积计算的吸蜡和图像捕获。注意尽量减少样品处理，因为处理会从样品中除去蜡。尽可能使用镊子，而不是您的手。
1. 切茎距离顶端分生组织约10cm，去除叶和枝，并平放在光，甚至背景与尺寸或已知尺寸的项目进行大小比较。通过在背景上书写标记每个样品。每个重复只需要一个茎。
2. 拍摄样品，使您拥有所有茎，其标签，以及视图中的标尺或尺寸标记（图1）。照片将用于以后计算茎表面积。
3. 浸泡在溶剂管中30秒以提取蜡。浸泡后可能会丢弃茎。
  
  图1.如何收集茎区数据。在浸入氯仿之前，对茎进行修剪和拍照以进行测量。圆形绿色贴纸用作尺寸的参考
ROSETTE LEAVES：玫瑰叶蜡提取和区域图像捕获计算。与茎一样，注意尽量减少样品处理，和使用镊子，而不是你的手，尽可能。
1. 拟南芥玫瑰花叶携带大约10％的花序茎上发现的蜡负载。因此，您将需要收集更多的叶组织以完成您的分析。目标是为每个重复收集至少 6个叶子。此外，您可能会发现叶蜡组成和负载比您对茎更多的变异性，因此使用更多的技术重复每个基因型（5-8）是可取的。
2. 由于拟南芥的莲座叶通常是弯曲的和弯曲的，所以难以基于2D图像计算它们的面积。我们的解决方案是首先将叶子浸在氯仿中30秒，然后，在蜡提取并且叶子柔软并用溶剂涂覆之后，将叶片平铺在塑料透明片上。透明片将与氯仿非常轻微地融化，有助于保持叶平。通过在透明片上书写标记每个样品（图2）。
3. 对每个复制的所有树叶重复此操作，为每个复制复制所有复制基因型。蜡提取后，用标签拍摄样品和标尺或尺寸标记。照片将在以后使用计算茎表面积。
4. 尝试快速工作，因为叶子将最终干后蜡提取，你的面积计算将不准确，如果你不以足够快的速度拍摄样品
  图2.如何收集叶面积数据。将叶子平放（如果在叶片中切割小切口，有时更容易），并在浸入氯仿后拍照进行测量。
通过将温和的氮气流从蒸发器歧管通过每个样品蒸发掉所有溶剂。在每次使用之前和之后，在氯仿中清洁歧管的钢针。
注意：较大的氮气流量不一定会减少蒸发样品所需的时间。使用低流量并定位针头，以便样品顶部有一个浅的凹坑，从气体的流出。如果您的样品是飞溅或冒泡，您正在浪费氮气，可能会失去您的样品。
溶剂干燥后，您应该能够在每个管的底部看到白色的蜡膜。使用玻璃注射器将此蜡残留物重新悬浮在100-200μl新鲜氯仿中，并转移到GC小瓶中的GC小瓶插入物。如上所述蒸发掉溶剂。这一次要注意氮的流出;因为小瓶插件很窄，很容易施加太多的氮气并损失浓缩的样品
溶剂完全干燥后，使用玻璃注射器向每个样品中加入10μl吡啶和10μlBSTFA + TMCS。紧紧密封GC小瓶，并在设置为80℃的烘箱中孵育1小时
从烘箱中取出小瓶，让它们冷却至室温1-2分钟。如上所述再次蒸发掉溶剂。
注意：吡啶，BSTFA和TMCS将比氯仿蒸发得慢得多。
将最终的衍生化残留物重悬在40μl氯仿中，并密封GC小瓶
在GC柱上注入样品。我们使用2.7：1分割用于茎蜡分析，并且以不分流模式运行叶蜡。对于两者，我们注射1μl样品。我们使用的程序如下：
     50°C 2分钟
    以40°C/min升至200°C
    持续1分钟
    以3°C/min升至320°C
    持续15分钟
计算样品的面积。将照片上传到Adobe Photoshop，然后使用魔术棒工具选择并记录每个样本的区域和以像素为单位的大小标记。由于标记的大小是已知的，您可以使用简单的比率来确定样本的2D区域（以厘米或英寸为单位）。对于叶，2D区域被原样使用。对于茎，2D区域表示茎直径乘以长度。因此，您将需要将2D面积乘以pi以获得整个茎的表面积。
GC运行完样品后，下载数据。通常，野生型样品将通过GC/MS使用与GC/FID相同的程序运行，以便可以从GC/FID确定谱图中每个峰的化学特性。或者，您可以将来自野生型样品的GC/FID色谱图中的峰与已经确定峰的色谱图进行比较，并确定系统中每个单体的预期保留时间。确定您感兴趣的蜡单体的峰和内标，并将其保留时间和峰面积复制到Microsoft Excel电子表格中。对所有重复和不同基因型重复此操作。
向每个样品中加入10μg二十四烷标准品。因此，您可以使用与二十四烷标准质量和峰面积的比率以及每种蜡单体的峰面积来确定每种单体的质量。最后，将每种单体的量除以样品面积，以便表示茎的单位μg/cm 2 的蜡单体量，或叶的μg/dm 2 。如果在分析中包括所有蜡单体，则可以计算这些值以确定每个样品的总蜡负载。

参考文献

Haslam，T. M.，Manas-Fernandez，A.，Zhao，L.and Kunst，L。（2012）。拟南芥 ECERIFERUM2是脂肪酸需要脂肪酸延长机制的一个组成部分酸延伸到特殊长度。植物生理 160（3）：1164-1174。