材料和试剂

设备

程序

I. 硫剥夺

在23℃下将感兴趣的菌株和对照菌株培养至早期对数期（细胞密度<2×10 6细胞/ml）。
在无菌的50ml反应管中旋转细胞（5分钟，1,000×g /孔，RT），并小心地重悬于10ml TAP-B中，再次离心（5分钟，1,000×g ，RT），并将细胞重悬于10ml TAP-B中
将细胞转移到无菌的25毫升锥形烧瓶中（最好是在这个烧瓶中设置培养基，并将重悬的细胞放回同一烧瓶中），在23℃下在中等光照下摇动16小时（30-50μmolxm ^-2 xs ^-1）。
旋转你的细胞（5分钟，1000×g ，RT），并小心地重新悬浮在10ml TAP-B/T中。
再次离心（5分钟，1000×g/hr，RT），并将细胞重悬于精确的10ml TAP-B/T中，将细胞转移回25ml锥形瓶中。
在黑暗中搅动细胞2小时（用铝箔包裹烧瓶或用纸板盒盖）

II。将细胞调节至相同量的叶绿素/细胞

转移0.5毫升培养物到微反应管（保持剩余的培养物在黑暗中摇动）
离心管（2分钟，20,000×g，4℃）并弃去上清液，将沉淀物在1ml甲醇中彻底重悬。
再次离心（1分钟，20,000xg，4℃），并使用上清液在652nm测量叶绿素，如果光密度高于1，则用甲醇稀释（不需要预冷）（不要忘记调整稀释因子的计算）。
计算叶绿素含量：
调整用TAP-B/T将叶绿素含量调整为80μg/ml ^-1：
离心细胞（5分钟，1,000×g /孔，RT），并在计算体积的TAP-B/T中仔细重悬，得到80μgChl/ml。
如果你的细胞缺少叶绿素，则比细胞数量更好地调节细胞数，制备1:10稀释的培养物并计数细胞（血细胞计数器，显微镜），旋转细胞并将细胞数调节到7.25×10 7，/sup>细胞/ml（如果使用绿色培养物，相当于〜80μg叶绿素/ml）

III。脉冲

IV。细胞裂解

V. 蛋白电泳

使用用于Laemmli-SDS-PAGE的方案并根据其分子量调整蛋白质的条件，例如用于分离光系统II反应中心的6M尿素-16％聚丙烯酰胺-SDS-PAGE凝胶蛋白D1（由psbA 基因编码）和D2（由psbD 基因编码）。

VI。考马斯染色和凝胶干燥

七，自然放射学

将磷光体成像屏幕放置在凝胶顶部，暴露1-3天（或使用X光胶片较长时间）。
扫描屏/开发X光胶片
比较您感兴趣的菌株中的条带与阴性对照，以鉴定受影响的蛋白质，例如。光系统II反应中心蛋白D1（由psbA 基因编码）的条带在（Morais等人，1998年）的图5中的 psbA 突变体FuD7 中调查突变体。

图1.步骤（VI-2）的方案。

食谱

TAP-B
20 mM Tris
7.5mM氯化铵 0.805mM氯化镁 0.34mM氯化钙 0.537mM K 2 HPO 4
0.463mM KH 2 PO 4>/
0.1％Hutner痕量元素
用乙酸调节pH至7
TAP-B/T
20mM tris
7.5mM氯化铵 0.805mM氯化镁 0.34mM氯化钙 0.537mM K 2 HPO 4
0.463mM KH 2 PO 4>/
用乙酸调节pH至7
Hutner微量元素（Hill和Kafer，2001）
50g Na 2 EDTA·2H 2 O·h/v 22g ZnSO 4·7H 2 O x / 11.4g H sub 3 BO sub 3
5g MnCl 2·4H 2 O·m/v 5g FeSO 4·7H 2 O·h/v 1.6克CoCl 2·6H 2 O 2·h/v 1.6克CuSO 4·5H 2 O 2 / 1.1g（NH 4）6 Mo 6 Mo 7 O 24·4H 2 O
填充dH 2 2至1000ml
缓冲区A
10 mM EDTA
10mM HEPES（pH7.8）
蛋白酶抑制剂混合物（根据制造商的说明书）
缓冲区B
10 mM EDTA
10mM三羟甲基氨基甲烷（pH7.8）蛋白酶抑制剂混合物（根据制造商的说明书）

致谢

该协议改编自Fleischmann和Rochaix（1999）公布的方案。这项工作得到了德意志交响乐团对J.N. （授予号Ni390/4-2）。

参考文献

Fleischmann，M.M.and Rochaix，J.D。（1999）。表征具有莱茵衣藻D2光系统II多肽中磷酸化位点改变的突变体。植物生理 119（4）：1557-1566。
Hill T.W.，Kafer E.（2001）。改进的曲霉属微生物培养基：微量元素和基本培养基盐溶液。真菌Gen新闻 48：20 -21
Morais，F.，Barber，J.and Nixon，PJ（1998）。叶绿体编码α亚单位的细胞色素b-559是在莱茵衣藻光和黑暗中装配光系统两个复合物所必需的。 45）：29315-29320。
Schwarz，C.，Bohne，AV，Wang，F.，Cejudo，FJ和Nickelsen，J。（2012）。