材料和试剂

分枝杆菌细胞（结核分枝杆菌）
7H9肉汤（Difco，目录号：271310）
甘油（Amresco，目录号：0854）
（Amresco，目录号：0442）
Middlebrook ADC（白蛋白 - 葡萄糖 - 过氧化氢酶）富集（BD Biosciences，目录号：211886）
Light 细菌膜电位试剂盒（Invitrogen，目录号：B34950）
提供以下解决方案：
1. DiOC 2（组分A），1.2ml 3mM的DMSO溶液
2. CCCP（组分B），300μl500μM的DMSO溶液
3. 磷酸盐缓冲盐水（PBS，组分C），10mM磷酸钠和145mM氯化钠，pH 7.4
补充7H9肉汤（见配方）

设备

孵育振动器
层流罩
实验室离心机
流式细胞仪（BD FACSVerseTM系统）

程序

在37℃下，在振荡（200rpm）下，在7H9肉汤中有氧地培养分枝杆菌细胞直到中对数期（OD 600为0.3）。
通过0.22μm孔径的膜过滤所需体积的PBS（组分C），准备足够的培养稀释液，每次测试500μl。
在使用前允许3mM DiOC 2（Novo等人，2000）和500μMCCCP溶液（组分A和B）达到室温。< br/>
用1ml过滤的PBS洗涤细胞两次。每次洗涤以4,000rpm的速度旋转5分钟。
在过滤的PBS中将分枝杆菌培养物稀释至约1×10 6个细胞/ml。
将500微升细菌悬浮液分装到流式细胞仪管中进行每次染色实验。准备两个额外的管用于去极化对照和未染色对照
向去极化的对照样品中加入25μl500μMCCCP（组分B）并混合
向每个流式细胞仪管中加入3μl3mM DiOC 2成分A）并混合（不向未染色的对照样品中加入染色剂）。在室温下孵育样品30分钟。染色的样品可以在5分钟后分析，但信号强度继续增加直到约30分钟
染色的细菌可以在配备有在488nm发射的激光的流式细胞仪中测定。荧光收集在绿色和红色通道中;用于分别检测荧光素和德克萨斯红染料的滤光片通常是合适的。前向散射，侧向散射和荧光应该用对数信号放大来收集
仪器调节对于检测相对小的颗粒例如细菌是特别关键的。使用未染色的对照样品来定位前向和侧向散射通道中的细菌群体。使用侧散射作为设置采集触发的参数。
在如上所述调节流式细胞仪之后，应用去极化的对照样品。使用正向对侧向散射和调整荧光光电倍增管电压使得绿色和红色MFI值近似相等的细菌门。不要设置补偿。
虽然红色和绿色荧光强度的相对量将随细胞大小和聚集而变化，但是红色与绿色荧光强度的比率可以用作膜电位的大小无关指示物。还可以通过使用正向对侧散射对细菌进行门控来处理数据，并且使用红色与绿色荧光的点图分析门控群体，将MFI值报告为线性值而不是通道。
在比率直方图上，在感兴趣的峰周围设置标记，并记录平均比值（图1）。对于红色与绿色荧光的点图，设置感兴趣群体周围的区域，并记录每个的红色和绿色MFI值。为了评估数据，将红色群体MFI除以绿色群体MFI。
在流式细胞仪中，细菌仅根据其大小和染色能力来鉴定

图1.分枝杆菌中的膜电位的检测使用分枝杆菌的群体平均荧光强度计算红/绿比率，所述分枝杆菌与3μMDiOC 2 2孵育30分钟，存在或不存在25μMCCCP

笔记

碳菁染料，包括DiOC 2和CCCP，是呼吸的抑制剂。虽然这些染料在推荐的染色期间不改变测定结果，但是DiOC 2和CCCP对细菌细胞都是有毒的，并且即使短暂的暴露也不能培养细胞。
细胞应该被适当地洗涤并且应该避免任何种类的聚集，因为它可能干扰测定。在仍然观察到任何聚集体的情况下，允许管静置一段时间，使得团块可以沉降。样品可以转移到新管中
应该保护碳菁染料DiOC 2（碘化3,3'-二乙基氧杂羰花青）和CCCP（羰基氰化物3-氯苯基腙）的溶液不受光照。

食谱

7H9肉汤，补充有0.1％甘油，0.1％80和Middlebrook ADC（白蛋白 - 葡萄糖 - 过氧化氢酶）富集

致谢

Amit Singh博士是一个Wellcome-DBT印度联盟中级研究员。这项工作得到了Wellcome-DBT印度联盟资助WTA01/10/355的支持。

参考文献

Chawla，M.，Parikh，P.，Saxena，A.，Munshi，M.，Mehta，M.，Mai，D.，Srivastava，AK，Narasimhulu，KV，Redding，KE，Vashi，N.，Kumar，D 。，Steyn，AJand Singh，A.（2012）。结核分枝杆菌 em> WhiB4调节氧化应激反应以调节体内存活和传播。
Novo，D.J.，Perlmutter，N.G.，Hunt，R.H。和Shapiro，H.M。（2000）。多参数流式细胞术分析抗生素对膜电位，膜通透性和细菌计数的影响金黄色葡萄球菌和微球菌。抗微生物剂化学 44（4）：827-834。
Novo，D.，Perlmutter，N.G.，Hunt，R.H。和Shapiro，H.M。（1999）。使用二乙基氧羰花青的细菌中精确的流式细胞膜电位测量和比例计算技术 Cytometry 35（1）：55-63