材料和试剂

形成双链衔接子的两个寡核苷酸，其具有与使用的限制酶的外切互补的突出端。在Mse I的情况下，突出端是5'TA，接头序列是5'-TACTCAGGACTCAT-3'和5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'。在两个序列杂交后（图1中的绿色矩形），前寡核苷酸5'端的两个核苷酸将构成5'TA突出端。这些寡核苷酸应该被设计为使得它们不类似于已知物种中的已知序列
预选择性引物，其与衔接子互补，在3'末端添加C核苷酸（5'-GATGAGTCCTGAGTAAC-3';图1中的引物P2），并且另一个与感兴趣的TE互补（引物P1在图1）。 TE特异性引物应设计为TE的5'末端的反向互补，Tm = 60℃，在TE之间30-50bp之间（以允许在下游测定中的序列验证）。应避免引物和TE的5'端之间的限制酶识别位点（TTAA）。衔接头和TE特异性引物应当在其5'末端设计有接头A和B序列（用于454-焦磷酸测序）。
NaCl
T4 DNA连接酶和缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0202）
限制酶MseI（New England Biolabs，目录号：R0525）
Taq DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶缓冲液（EURx，目录号：E2500）
MgCl 2
dNTP mix

图1. TD-454焦磷酸测序方法的概述（a）基因组样品用限制酶片段化，连接到适配器（绿色矩形）; （b）片段经历PCR 与适配子特异性的引物（含有454接头序列）和对分析的TE特异性的引物（含有454接头）序列）; （c）将所得PCR扩增子用454进行测序焦磷酸测序仪。

设备

程序

A. 适配器对准备

B. 限制/连接

加到0.2ml试管中：1μl10×连接酶缓冲液，1μl0.5M NaCl，1μl衔接子对，120单位T4连接酶，2单位Mse I，300-500 ng的基因组DNA和ddH 2 O至最终体积为10μl
充分混合并在37℃孵育2-3小时
通过加入90μlddH 2 O稀释反应1:10
该反应可以在-20℃下保存

C.预选择性扩增

加入0.2ml管中：2μl10x Taq DNA聚合酶缓冲液，2μl25mM MgCl 2，0.8μldNTP混合物，1单位Taq DNA聚合酶，1μl50ng/μl衔接子特异性预选择性引物，1μl50ng /μl转座子特异性引物，4μl限制性/连接反应产物（用Mse I I切割）和ddH 2 O，最终体积为20μl。
使用热循环仪进行PCR，使用以下程序：
1. 94℃3分钟
2. 94℃30秒
3. 60℃，30秒
4. 72℃1分钟
  返回阶段b 29次。
在454-焦磷酸测序机中运行相关大小的PCR产物（通常在150-550bp之间的窄带，例如300-500bp，取决于预期的扩增子数）（图2）。

图2。使用来自衔接子的引物和来自类似Stowaway的MITE的启动子（称为 Eos ）的预选择性扩增的PCR产物的实例，（登录号TL05;中间泳道）的预先选择性扩增，以及预选择性扩增的山羊草二倍体小麦（登录号TMU06;右泳道）。

致谢

转座子（TD）展示方法适应于扩增片段长度多态性（AFLP）（Vos等人，1995 Nucl Acid Res 23：4407-4414）。这项工作得到了以色列科学基金会（拨款＃142/08）给Khalil Kashkush的资助。

参考文献