材料和试剂

一抗：自产或商业订购
注意：对于自产的一级抗体，优化抗体浓度为1-50μg/ml）; 尝试5μg/ml作为起点。对于商业初级抗体，通常以1：1,000稀释作为起点，然后根据初步数据调整工作浓度。
二抗（以下是最常见的二抗）：
1. 山羊抗兔IgG（Life Technologies，Molecular Probes/Alexa Fluor 488，目录号：A-11008）
2. 山羊抗兔IgG（Life Technologies，Molecular Probes/Alexa Fluor 594，目录号：A-11012）
3. 山羊抗mosue IgG（Life Technologies，Molecular Probes/Alexa Fluor 488，目录号：A-11001）
4. 山羊抗 - mosue IgG（Life Technologies，Molecular Probes/Alexa Fluor 594，目录号：A-11005）
5. 山羊抗人IgG（Life Technologies，Molecular Probes/Alexa Fluor 488，目录号：A-11013）
6. 山羊抗人IgG（Life Technologies，Molecular Probes/Alexa Fluor 594，目录号：A-11014）
  注意：我们通常稀释商业第二抗体在1：200作为起点。确保在稀释前旋转次级抗体的储备溶液以防止沉淀的荧光团导致高背景。我们通常将第二抗体等分，并储存在-20℃下。
4'，6-二脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Boeringer Manheim，236 276）（制备1mg/ml储备液，1,000x）
多聚甲醛（16％溶液）（Electron Microscopy Sciences，目录号：15170）
甲醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP 1105-4）
盖玻璃（12mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-545-82）
聚-L-赖氨酸（MW 150,000-300,000）（Sigma-Aldrich，目录号：P1399）
Fluormount-G ^TM（安装溶液）（SouthernBiotech，目录号：0100-01）
硝酸
盐酸
液氮
PBS-BT溶液（见配方）
正常山羊血清（Jackson Laboratory，目录号：005-000-001）（参见Recipes）

设备

玻璃烧杯
培养皿
紫外线照射
24孔板
6孔板
60 mm皿
parafilm

程序

准备护目镜
1. 在通风橱中的大玻璃烧杯中制备100ml酸溶液。
  注意：酸溶液由2份硝酸和1份HCl组成，颜色为橙红色。
2. 将12 mm盖玻片逐一放入酸溶液中，以便盖玻片在酸中均匀洗涤。
3. 让遮阳镜坐在酸中2小时或偶尔过夜旋转。
4. 将滗析酸溶液倒入另一个大玻璃烧杯中; 用NaOH颗粒中和酸注意：使用NaOH，溶液会剧烈沸腾，所以要小心。
5. 用ddH 2 O 2清洗眼镜盖，直到pH升至7.0
6. 加入足量的500μg/ml聚-L-赖氨酸溶液以覆盖所有护目镜，并偶尔旋转2小时。
7. 倾析聚-L-赖氨酸溶液（溶液可重复使用）。
8. 用ddH <2> O洗涤护目镜3次。
9. 在培养皿中单独干燥每个盖玻片，避免盖玻片粘在表面注意：如果盖玻片粘在培养皿的表面，可以通过加入少量液氮容易地除去。
10. 干燥后，将所有的盖玻璃放入培养皿中，并在首次使用前进行紫外线照射过夜注意：对于长期存放的护目镜，为了不育而重新照射。
在coverglasses的生长细胞
1. 将细胞分开到含有盖玻片或有空隙的载玻片的组织培养皿上注意：
  1. 我们通常在24孔板的一个孔中放置一个盖玻片; 或在6孔板的一个孔中不超过2个盖玻片，或在60mm皿中不超过5个盖玻璃。
  2. 上下移动或摇动培养皿，以确保细胞不会集中在培养皿中心。确保盖玻片和组织培养皿之间没有气泡。
2. 生长细胞至70-100％汇合
细胞的固定和渗透
1. 将盖玻片或有腔室的幻灯片转移到另一个含有足够甲醇（-20°C股票）的组织板，固定10分钟或几个星期。
  或者，将细胞转移到包括PBS的另一板。弃去PBS，加入200μlPBS加20μl16％多聚甲醛。在室温（RT）下摇动平板15分钟。
  注意：
  1. 直接转移到甲醇，无需进行PBS清洗。
  2. <16>多聚甲醛需要储存在-20°C，最终工作浓度为1.6％。
  3. 甲醛通过交联蛋白质来保存抗原，其具有在其正确定位和GFP中保留大多数亚细胞抗原的优点。甲醇通过脱水细胞使抗原沉淀，它可用于观察细胞骨架元素如微生物，肌动蛋白和其他相关结构，但它会破坏GFP。
2. 小心地转移盖玻片或有腔室的幻灯片从板，并将细胞侧向上到固定的石蜡膜。转移后立即用100μlPBS洗涤盖玻片或带腔玻片，切勿干燥细胞
3. 加入100微升PBS-BT溶液到盖玻片或有室幻灯片，让在室温下30分钟渗透和阻止细胞。
  注意：对于严格阻断，可以使用4-6％正常山羊血清（NGS）。
染色和安装单元
1. 孵育细胞在40μl一抗（1μg/ml最终一次抗体浓度，稀释在PBS-BT）在室温下30分钟。
2. 用PBS-BT冲洗两次，然后用100μlPBS-BT洗涤两次，每次5分钟
3. 将细胞在室温下在40μl第二抗体（1μg/ml最终二次抗体浓度，在PBS-BT中稀释）中温育30分钟。
4. 用PBS-BT冲洗两次，用PBS-BT清洗一次，5分钟，然后用PBS清洗5分钟。
5. 孵育细胞在40μlDAPI（1μg/ml终浓度，在PBS中1:1000稀释）2分钟，然后用PBS洗涤一次。
6. 添加5-10微升安装溶液到每个盖玻片的干净的显微镜载玻片，将染色的盖玻片细胞侧向下放置在来自一个边缘的安装溶液上; 允许安装溶液覆盖盖玻片的整个表面，避免气泡
7. 让安装溶液干燥并在室温下自密封30分钟。

食谱

PBS-BT溶液
10ml 10×PBS
3 g BSA（至3％）
1ml 10％Triton X-100（至0.1％） 1ml 5％NaN 3
储存在4°C
正常山羊血清
制成4-6％的PBS溶液

致谢

该方案从在Guowei Fang博士（Stanford University，Stanford，CA，USA）的生物学实验室开发的免疫沉淀方案进行了修改。该协议最初由Jim Wong博士开发。这项工作得到了生物医学研究（G.F.）的Burroughs-Wellcome职业奖和国立卫生研究院（GM062852至G.F.）的资助。

参考文献

Wong，J。和Fang，G。（2006）。 HURP控制主轴动力学以促进适当的细胞间粘附张力和有效的动粒捕获。 J Cell Biol 173（6）：879-891
Zhu，H.，Coppinger，J.A.，Jang，C.Y.，Yates，J.R.，3rdand Fang，G。（2008）。 FAM29A通过募集NEDD1-γ-微管蛋白复合物到有丝分裂纺锤体来促进微管扩增。 a> J Cell Biol 183（5）：835-848
Zhu，H.，Fang，K。和Fang，G。（2009）。 FAM29A，Plk1调节的目标，控制NEDD1在有丝分裂纺锤体和中心体之间的分配。 J Cell Sci 122（Pt 15）：2750-2759。