材料和试剂

LC3B用于自噬的抗体试剂盒（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：L10382）
Alexa fluor 555山羊抗兔IgG（H + L）（2mg/ml）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：A21428）
甲醛
BSA
DAPI（2.5μg/ml）（Sigma-Aldrich）
AF1抗褪色-25ml（Citifluor，England）
夹具用于解剖
Pap Pen Liquid Blocker Super Pap Pen（Daido Sangyo Co.Ltd，Japan）
玻璃片
阻止缓冲区（参见配方）
陆地等度磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见配方）
固定剂（见配方）
渗透试剂（参见配方）

设备

黑框
使用配有63x/1.25物镜（油浸）和AxioVision 4.8.1软件（Zeiss）的Apotome（结构化照明）的荧光显微镜（Axio Observer-A1，Zeiss）

程序

在封闭缓冲液中稀释LC3B兔多克隆抗体以制备0.5μg/ml工作溶液（1μl储备溶液在1,999μl封闭缓冲液中）。
在玻璃载玻片上用防液笔画一口井（直径约1厘米）。
解剖地面同位素并收集脂肪组织，特别是那些围绕神经线（长度约6毫米）（图1）。

图1.一旦收集（B），在肺泡肿瘤（A）和被脂肪细胞（Ad）包围的神经索的神经索的位置。
将被脂肪细胞包围的神经索（脂肪组织）沉积在所绘制的孔的中间。
加入150微升的3.7％甲醛固定剂在陆地等量PBS PBS组织
在室温（RT）下在含有湿纸的黑盒中孵育15分钟。
除去固定剂，用地面等离子体PBS（用洗涤150μlPBS洗5分钟）洗涤组织三次。
在最后一次清洗后取出PBS。
准备0.2％Triton X-100在陆地等度磷脂和施加150脂肪组织。
小心不要溶解拒液笔，使组织总是浸入溶液中。
在黑盒子中用湿纸在室温下15分钟孵育。
用防液笔在新鲜载玻片上绘制孔（〜1cm直径）。
用镊子收集脂肪组织，并将其转移到新鲜的幻灯片上。
加入150μl步骤1中制备的稀释的一抗在脂肪组织上。
在室温下在含有湿纸的黑盒中孵育60分钟。
取出一抗溶液，用地面等离子体PBS（用洗涤用150μlPBS洗5分钟）洗涤组织三次。
在最后一次洗涤后取出PBS。
在封闭缓冲液中稀释山羊抗兔二抗以制备5μg/ml工作溶液（1μl储备溶液，在399μl封闭缓冲液中）。
向脂肪组织中加入150μl山羊抗兔二抗。
在黑盒子中用湿纸在室温下孵育60分钟。
取出抗山羊第二抗体溶液，用地面等离子体PBS洗涤细胞三次（洗涤用150μlPBS洗涤5分钟）。
将制剂安装在DAPI（2.5mg/ml）的混合物中以标记细胞核和Citifluor（AF1抗褪色）。
用装有63x/1.25物镜（油浸）的开口机和AxioVision 4.8.1软件（图2）的落射荧光显微镜进行检测。

图2.从用Wolbachia菌株wVulC感染的肺泡细胞收集的脂肪细胞中LC3B标记的观察（Le Clec'h 等，2012）。

食谱

陆地等度PBS
137 mM NaCl
1.5mM Na 2 HPO 4。
8mM KH 2 PO 4 4/
3 mM KCl
pH 7.4
封锁缓冲区： BSA在地上等磷蛋白PBS中稀释1％
固定剂：3.7％甲醛在地上等量PBS中
渗透试剂：0.2％Triton X-100在地上等量PBS PBS中

致谢

我们感谢UMR EBI CNRS 7267的所有技术人员。我们还感谢Winka Le Clec'h对协议的宝贵意见。这项工作得到了Agis Nationale de la Recherche（ADaWOL ANR-09-JCJC-0109-01由Mathieu Sicard协调）的支持。

参考文献

Chevalier，F.，Herbiniere-Gaboreau，J.，Bertaux，J.，Raimond，M.，Morel， F.，Bouchon，D.，Greve，P。和Braquart-Varnier，C。（2011）。陆地等足类动物免疫细胞效应物 Armadillidium vulgare ：与其入侵者会面，Wolbachia。 PLoS One 6（4）：e18531。
Le Clec'h，W.，Braquart-Varnier，C.，Raimond，M.，Ferdy，J.B.，Bouchon，D。和Sicard，M。（2012）。宿主切换后的Wolbachia高毒力：当自噬受到伤害时。 PLoS Pathog 8（8）：e1002844。