材料和试剂

L。乳酸细胞
Whatman，Protran？BA85硝化纤维素膜（2.5cm直径，0.45μm孔径硝酸纤维素滤膜）（Sigma-Aldrich，目录号：Z670634）
LiCl
K 2 HPO 4
KH ₂ PO ₄
< sup> 14 C-标记的氨基酸（PerkinElmer）
注意：储备溶液通常含有50-100mCi/ml，相当于100至500μM浓度。
闪烁液（例如Emulsifier Scintillator Plus，Packard Bioscience）
100mM磷酸钾（KPi）pH5.8缓冲液（4℃）（见配方）
KPi在4℃含有0.2％葡萄糖（参见配方）

设备

过滤设置（如十位过滤歧管，目录号：FH225V）
真空泵
恒温水浴用磁力搅拌器
液体闪烁分析仪（例如Tri-Carb 2000CA，Packard Instruments）
玻璃管（10×75mm）
镊子
磁力搅拌棒
计时器
涡流

程序

L。乳酸菌在后期指数生长期收获 OD 660为0.6和1.0，洗涤并在钾中重悬浮至OD 660为2 磷酸盐（KPi）缓冲液，保存在冰上
通过短暂涡旋匀浆细胞悬浮液。
分布100微升的细胞悬液的5微升玻璃管的alliquotes。保持冰上。
在连续搅拌下，在30℃下孵育其中一个管5分钟
在安装过程中安装过滤器并应用真空
在t = 0时，向5个管中的每个中的细胞中加入1μl的14 C标记的氨基酸储备溶液，得到1-5μM浓度。
在每个时间点t = 0.5,1,2,4分钟，加入2ml冰冷的0.1M LiCl 并在硝酸纤维素滤膜上过滤细胞。对于大多数氨基酸，这四个时间点覆盖完整的摄取曲线。有时，可能必须选择其他时间点。
立即用另外2ml的0.1M LiCl洗涤管，并在同一过滤器上过滤
取出真空，用镊子将过滤器转移到2ml Eppendorf管中，并将新的过滤器放回下一个样品的过滤装置。
对于零时间点（最终管），在30℃下跳过孵育（步骤3）;在冰上向细胞悬浮液中加入放射性，随后立即加入2ml LiCl并过滤加冲洗（步骤6和7）。将样品保持在冰上防止样品处理过程中的吸收
将1μl的14 C标记的氨基酸储备溶液加入到2ml Eppendorf管中，以确定每个时间点使用的放射性的总量。
向Eppendorf管中加入1.8 ml闪烁液
通过闪烁计数测量保留在过滤器上的放射性。在使滤器加细菌溶解在闪烁液中之后获得最佳结果
摄取（速率）可以从保留的活性和总添加活性计算，并以nmol氨基酸/（mg蛋白x分钟）表示。氨基酸的量由制造商提供的数据计算通过细胞蛋白的标准测定法测定蛋白质的量

食谱

0.1M KPi pH5.8缓冲液（1,000ml）将1×MK 2 HPO 4和1M KH 2 PO 4 4混合至最终pH为5.8，稀释10× 与dH <2> O。
混合10ml KPi pH5.8和0.1ml 20％葡萄糖溶液。储存于4°C。

致谢

这个协议改编自Trip 等人（2013）中最近使用的协议。

参考文献

Trip，H.，Mulder，N.L。和Lolkema，J.S。（2013）。乳酸乳球菌的次级氨基酸转运蛋白的克隆，表达和功能表征 > 。 J Bacteriol 195（2）：340-350。