材料和试剂

发芽板（灭菌水中1％琼脂）
B5盐（Wako Pure Chemical Industries，目录号：399-00621）
Gamborg的维生素溶液
BAP（Wako Pure Chemical Industries，目录号：020-07621）
1-萘乙酸（NAA）
Acetosyringone
MES
（NH 4）_{2 4}
Phytagel（Sigma-Aldrich，目录号：P8169）
Meropen（Dainippon Sumitomo Pharma）
潮霉素B
LB培养基（nacalai tesque，目录号：20066-95）
共培养培养基（见配方）
YMB介质（参见配方）
愈伤组织培养基（参见食谱）
射击伸长介质（见配方）
根诱导培养基（见配方）
根伸长培养基（见配方）

设备

清洁长椅
L。（我们使用几种类型的生物素，例如从NIPPON MEDICAL& CHEMICAL INSTRUMENTS CO。，LTD。购买的LH-410S）。
手术刀
灭菌盘（直径9cm×2cm）
灭菌品红色盒
灭菌滤纸（直径7cm）
灭菌滤纸（6 x 6厘米）
蛭石（Hakugen）

程序

A. 植物生长

砂纸表面的。 japonicus 岐阜或MG-20种子，然后将其在2％次氯酸钠溶液中孵育5分钟。用无菌水洗涤种子几次，并在灭菌水中孵育种子过夜
表面灭菌的日本G>或MG-20种子在萌发平板中萌发并生长。
将板垂直放置在生长箱中（Gifu; 23℃24小时黑暗，前3天，23℃16小时光照/8小时黑暗，接下来的2天，MG-20; 23℃24小时黑暗，天，23℃16小时光照/8小时黑暗，接下来的2天）。黑暗中的孵育时间取决于生态型（Gifu的下胚轴生长速度比MG-20慢）。

B. 培养土壤杆菌

条纹A。在适当的抗体的LB平板上在28℃下将所需的构建物包埋2天，然后将细菌扩散到灭菌的盘（直径9cm）周围并孵育1天。我们使用AGL1作为农杆菌菌株。

C. 感染。 rhizogenes 。 japonicus

将约5毫升的无菌滤纸（6×6厘米）在新的盘中，并倒入20-25毫升共培养培养基（图1A）。将培养基倒入培养皿的底部，然后逐渐渗透到填充的滤纸的顶部。它使我们能够用介质识别滤纸的饱和度
用LB板上的细菌扩散器收集细菌，并悬浮5ml YMB培养基
将灭菌过的滤纸（直径7-8厘米）放入新的培养皿中，用细菌悬浮液通过移液使其饱和。
将少年植物放在滤纸上，用手术刀切下下胚轴约3毫米长。
将下胚轴片段转移到用共培养培养基饱和的填充滤纸的顶部，并将板置于生长室（23℃24小时黑暗）中6天（图1B）。

图1.感染 A。 tumefaciens 与 L。 japonicas

D.愈伤组织诱导

将下胚轴片从共培养培养基转移到胼us培养基（约1cm厚）上，并将板置于生长室（23℃16小时光照/8小时黑暗）2-5周（图2A）。每5天将下胚轴转移到新培养基上。
在2-3周内，愈伤组织应该从下胚轴的尖端开始发育。当它们的尺寸超过1mm时，将它们从下胚轴切下并转移到新培养基上（图2B）。你可以垃圾白下胚轴，因为它不太可能从它们发展愈伤组织。

图2.愈伤组织诱导

E. 拍摄感应

转移愈伤组织到胼us培养基上没有潮霉素B（约1厘米厚），并将板在生长室（23℃16小时光/8小时黑暗）不超过7周。每5天将愈伤组织转移到新培养基上（图3）。拍摄开始出现在大约3周。

图3.射击诱导

F.射击伸长

当枝条开始出现时，将愈伤组织转移到枝条延长培养基（约1cm厚）上，并将该板置于生长室（23℃16小时光照/8小时黑暗）中不超过6周。每5天将愈伤组织转移到新培养基上（图4）。

图4.射击伸长率

G.根诱导

1.当枝条长度变为约1cm时，将枝条从愈伤组织切下，并将其轻微粘在根诱导培养基（约1cm厚）中。
2.将板置于生长箱（23℃16小时光照/8小时黑暗）中10天（图5）。

图5.根源诱导

H.根伸长

转移和粘附芽到根伸长介质（约3厘米厚），并将洋红盒放在生长箱（23℃16小时光/8小时黑暗），直到它们的根长度变成约2-3厘米（图6）。

图6.根伸长率

I.归化

将植物移植到100％蛭石中，并且在高湿度下至少第一个星期（23℃16小时光照/8小时黑暗）使其生长，并且保持生长它们用于进一步分析。为了保持高湿度，我们用Saran包装覆盖植物盆。

食谱

共培养培养基（pH 5.5）
1/10x B5盐
1/10x Gamborg的维生素溶液
0.5μg/ml BAP（Gifu）
0.2μg/ml BAP（MG-20） 0.05μg/ml NAA
5mM MES（pH 5.2）
20μg/ml乙酰丁香酮
准备1/10x B5盐溶液并调整pH值，并高压灭菌。高压灭菌后加入剩余的组分。
YMB培养基（100ml） 0.2克甘露醇 0.04g酵母提取物
0.02g MgSO 4 .7H 2 O 2 0.01克NaCl 混合所有组分，高压灭菌混合物在使用前加入1ml 0.3M磷酸钾缓冲液（pH 6.8）
愈伤组织培养基（pH 5.5）
1x B5盐
1x Gamborg的维生素溶液
2％蔗糖 0.5μg/ml BAP（Gifu）
0.2μg/ml BAP（MG-20）
0.05μg/ml NAA
10mM（NH 4）2 SO 4 4
0.3％植物凝集素 12.5μg/ml meropen
15-40μg/ml潮霉素B（您需要找到最佳浓度的潮霉素B，因为它的纯度因材料而异）
混合1×B5盐和2％蔗糖并调节pH，并加入0.3％植物凝胶。高压灭菌混合物。高压灭菌后加入剩余的组分
芽伸长培养基（pH 5.5）
1x B5盐
1x Gamborg的维生素溶液
2％蔗糖 0.2μg/ml BAP
0.3％植物凝集素 12.5μg/ml meropen
混合1×B5盐和2％蔗糖并调节pH，并加入0.3％植物凝胶。高压灭菌混合物。高压灭菌后加入剩余的组分
根诱导培养基（pH 5.5）
1/2x B5盐
1/2x Gamborg的维生素溶液
1％蔗糖 0.5μg/ml NAA
0.4％植物凝集素 12.5μg/ml meropen
混合1/2×B5盐和1％蔗糖并调节pH，并加入0.4％植物凝胶。高压灭菌混合物。高压灭菌后加入剩余的组分
根伸长培养基（pH 5.5）
1/2x B5盐
1/2x Gamborg的维生素溶液
1％蔗糖 0.4％植物凝集素 12.5μg/ml meropen
混合1/2×B5盐和1％蔗糖并调节pH，并加入0.4％植物凝胶。高压灭菌混合物。高压灭菌后加入剩余的组分。洋红盒用于这种根伸长介质。

致谢

这项工作得到MEXT/JSPS KAKENHI，日本（22870035,23012038,25114519 to Takuya Suzaki）的支持。

参考文献

Handberg，K。和Stougaard，J。（1992）。 Lotus japonicus ，一个自动的，用于经典和分子遗传学的二倍体豆科植物。植物学杂志 2（4）：487-496
Stiller，J.，Martirani，L.，Tuppale，S.，Chian，R.-J.，Chiurazzi，M。和Gresshoff，P.M。在模式豆科植物中的转基因植物的高频转化和再生 em> 。 J Exp Bot 48（7）：1357-1365。
Suzaki，T.，Yano，K.，Ito，M.，Umehara，Y.，Suganuma，N.and Kawaguchi，M。（2012）。 Lotus japonicus中根瘤结核发育期间的皮质细胞分裂的阳性和阴性调节伴有生长素反应。 139（21）：3997-4006
Thykjaer T.，Schauser L.，Danielsen D.，Finneman J.，Stougaard J.（1998）。转基因植物：土壤杆菌 - 介导的二倍体豆科植物Lotus japonicus的转化。在 Cell Biology：A laboratory handbook 中。第二版vol 3. Academic Press