材料和试剂

Click-iT细胞反应缓冲液试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：C10269）
EdU（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：A10044）}
Alexa Fluor 488叠氮化物（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：A10266）
或Alexa Fluor 594叠氮化物（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：C10270）
4％多聚甲醛（PFA）在PBS中的溶液
去离子水（ddH 2 O）
聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P8920）
TEFLON印刷载片8孔，直径6mm（Electron Microscopy Sciences）
使用DAPI（Vector Laboratories，目录号：H-1200）的Vectashield
指甲油
EdU溶液（EdU的分子量：252.22g/mol）（参见配方）
0.1 M甘氨酸（1 x PBS）（参见配方）

设备

湿室（具有润湿的纸塔的箱子;可以防止光和至少8×10cm <2>）
显微镜盖玻片，22×50cm 2 （Fisherbrand ）
离心机
28℃5％CO 2细胞培养箱
荧光显微镜

程序

I. 锥体虫细胞的EdU标记

注意：
1）该方案尚未用于锥体的血流形式。但是，它也应该对锥体的血液形式也很好。
2）从步骤3到协议结束，在室温（ RT ）下操作。 3）从第9步，通过用盖子或埃彭多夫管用箔纸覆盖盒子避免光照。在步骤7,8和10中，使用100或200μl移液管从每个孔中除去溶液。

在28℃，5％CO 2培养箱中，在补充有10％FBS的10ml SDM-79培养基中培养原环状锥虫。
向细胞培养物中加入EdU溶液，最终浓度为50μM至100μM，并继续按照计划在与步骤1相同的条件下孵育30分钟至3小时。
然后将锥虫体细胞在700×g下沉淀5分钟
用1ml 1×PBS洗涤细胞一次，并在1×PBS中以约2×10 7个细胞/ml重悬细胞。
用聚-L-赖氨酸（0.1％w/v H 2 O）涂覆8孔玻璃载玻片。
添加25微升细胞悬液在潮湿的房间（见设备1）的每个孔，座位5分钟
取出细胞悬液，加入40μl4％多聚甲醛固定细胞5分钟
取出固定液，用50μl0.1 M甘氨酸洗涤细胞两次，每次5分钟
准备Click-iT反应鸡尾酒（使鸡尾酒新鲜，保持黑暗）对于200μl（1个载玻片或8个孔，25μl/孔）：
组件A：1x TBS 176μl
组分B：100mM CuSO 4。 4微升
组分C：缓冲添加剂&    20微升
1mM Alexa-488-叠氮化物     1微升
（或1微升Alexa-594叠氮化物       1微升）
在步骤8从每个孔中删除洗涤缓冲液，每孔加入25μl反应混合液，并在室温下孵育1小时。防光。
孵育1小时后，取出反应混合液，用50μl1×PBS洗涤两次。防光。
安装幻灯片与Vectashield安装介质与DAPI（1.5微克/毫升），密封指甲油和座位15〜30分钟。防光。
通过荧光显微镜检查（使用63x或100x物镜）（图1）

图1.原核细胞形式的锥体虫细胞的EdU标记。通过在收获前向培养基中加入100μMEdU 1小时来测量DNA合成。然后将细胞粘附到聚-L-赖氨酸包被的8孔载玻片上，用Alexa-488-叠氮化物检测EdU，随后用1.5μg/ml DAPI对DNA和核进行复染。 EdU面板中的插图是相位面板右侧的单元的放大的EdU标记图像。 N，核; k，kDNA。红色，DAPI; Green，EdU。条，5μm。

II。 EdU标记从锥虫分离的kDNA网络

注意：
1）从步骤3到协议结束，在RT（室温）下操作。
2）从第7步，请用盖子或埃彭多夫管用铝箔纸覆盖盒子避免光照。
3）在步骤8和9中，请使用100或200μl移液管从每个孔中除去溶液。

在补充有10％FBS的SDM-79培养基中在28℃，5％CO 2培养箱中培养原环形锥体虫。对于kDNA分离，总共制备超过1×10 8个细胞
以50μM至100μM添加EdU溶液至细胞培养物，并继续按计划孵育30分钟至3小时。
分离≥5×10 7个锥体虫体细胞的kDNA网络。
将8孔玻璃载玻片与1:50稀释的聚-D-赖氨酸在ddH 2 O中涂覆。
将1μl分离的kDNA网络与19μl1×PBS（首先在每个孔中加入1×PBS，然后将kDNA与1×PBS在孔上混合）混合。
注意：在对分离的kDNA网络进行EdU标记之前，建议仅通过以下步骤5,6,10和11（每个区域中至少15个kDNA网络继续）通过DAPI染色检查kDNA网络丰度。
允许kDNA网络在玻片上（聚-L-赖氨酸涂层）在潮湿室中室温下30分钟（参见设备1）。
准备Click-iT反应鸡尾酒（使鸡尾酒新鲜，保持黑暗）对于200μl（1个载玻片或8个孔，25μl/孔）：
组件A：1x TBS     176μl
组分B：100mM CuSO 4。 4微升
组分C：缓冲添加剂&    20微升
1mM Alexa-488-叠氮化物     1微升
（或1微升Alexa-594叠氮化物       1微升）
从每个孔中删除kDNA和1×PBS混合物，并添加25μl反应混合物每孔，并在室温下孵育1小时。防光。
孵育1小时后，取出反应混合液，用50μl1×PBS洗涤两次。防光。
用Vectashield固定介质用DAPI（1.5μg/ml）装载载玻片，并用指甲油密封，并座15-30分钟。防光。
通过荧光显微镜检查（使用100倍物镜）（图2）

图2.来自锥体虫细胞的分离的kDNA网络的EdU标记。从EdU标记的细胞分离网络，并粘附到8孔玻璃载玻片上，然后加入Alexa-488-叠氮化物绿色），网络用1.5μg/ml DAPI（红色）染色。箭头，单位大小的复制前kDNA; 箭头，双倍大小的复制后kDNA

食谱

EdU溶液（EdU的分子量：252.22g/mol）将12.16mg EdU溶解在1ml ddH 2 O中用于50mM EdU溶液
将12.16mg EdU溶解在1ml ddH 2 O中用于50mM EdU溶液
1x PBS
将以下物质溶于800ml蒸馏H 2 O中 8克NaCl
0.2克KCl
1.44g的Na 2 HPO 4
0.24g的KH 2 PO 4 sub/
调节pH至7.4; 然后用另外的蒸馏H 2 O调节体积至1L。通过高压灭菌消毒。

致谢

我感谢Paul Englund和Robert Jensen的所有实验室成员进行了有益的讨论。这项工作是由NIH授权AI058613支持。

参考文献

Wang，J.，Englund，P.T.and Jensen，R.E。（2012）。 TbPIF8，与酵母Pif1解旋酶相关的锥虫蛋白对细胞活力和线粒体基因组维持至关重要。 Mol Microbiol 83（3）：471-485。