材料和试剂

Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11995-065）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
SureFire ^®试剂（包括裂解，活化和反应缓冲液）（TGR BioSciences，目录号：TGRES500）
AlphaScreen General IgG（蛋白A）检测试剂盒（PerkinElmer，目录号：6760617）
白色ProxiPlate 384孔微孔板（PerkinElmer，目录号：6008280）
TopSeal（PerkinElmer，目录号：6005250）
NaCl
KCl
Na HPO ₄
KH ₂ PO ₄
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
检测缓冲区（参见配方）

设备

Fusion-α板读数器或Envision板读数器与适当的Alphascreen检测模块（PerkinElmer）
无菌96孔透明平底板（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353072）
加湿培养箱
多通道移液器
微量移液器
轨道振动器

程序

注意：
1）细胞可以稳定或瞬时表达感兴趣的受体。 2）推荐首先进行时间分析以确定配体介导的pERK1/2最大的时间。（推荐浓度100×K d）。
3）然后可以对随后的时间序列进行精制，以确定最大配体诱导的pERK1/2发生的精确时间。

I. 细胞制备

在合适的营养培养基（例如DMEM，10％FBS，无抗生素）中将细胞接种到无菌96孔板中，并在37℃，5％CO 2的潮湿环境中培养， /约为〜90％，第二天融合（约24小时）。

注意：根据所使用的细胞系的细胞数目的优化是必要的（我们建议每孔10,000-50,000个细胞的起始范围）。 CHO FlpIN细胞的推荐密度为30,000个细胞/孔

II。刺激

播种后一天，吸出营养培养基，用100μlPBS冲洗一次，并更换为90μl预热的DMEM（无FBS）。
在37℃，5％CO 2的潮湿环境中孵育至少4小时（推荐6小时，直到过夜（O/N））。
准备在DMEM中的10x终浓度的配体的系列稀释液，对于10μl/孔，以一式两份（最小）进行，并且如果进行时间进程则足够多的时间点。
注意：使用的浓度范围将取决于配体对受体的亲和力。对于初始时程测试，选择配体和DMEM对照的浓度100×K d。然后可以在随后的实验中改进浓度。如果使用肽或"粘性"配体，在含0.1％BSA的DMEM中制备连续稀释液。
在DMEM中制备合适浓度的FBS，足以进行10μl/孔，以一式两份（最小）进行，并且如果进行时间进程，足够多的时间点。
注意：这是实验的内部控制 - FBS促进pERK1/2。 FBS在CHO FlpIN细胞系中的推荐最终浓度为3-10％。
在DMEM中预孵育后，向细胞中加入10μl10x制备的配体或FBS，总体积为100μl，最终浓度为1x。
注意：对于初始时间，从90分钟开始，并在每个时间点向细胞添加配体或FBS，直到时间0（无添加）。对于浓度反应，在通过时间过程确定的最大诱导的pERK1/2时添加配体或FBS。
刺激完成后，从细胞中快速去除含配体的培养基。
注意：根据细胞类型，这可能涉及轻拂或轻柔吸气。
加入50μl1x Surefire ^？裂解缓冲液。
注意：裂解体积的优化是必要的，并且取决于细胞类型，受体的表达水平和与pERK1/2途径偶联的效率。推荐在CHO FlpIN细胞系中起始裂解体积为30-100μl。
孵育裂解物在室温（RT）5-10分钟在轨道摇床

III。检测

在减弱的照明条件下，准备检测缓冲液。
转移5微升细胞裂解液从每个孔到384孔ProxiPlate。
在减光条件下，向每个样品中加入8.5μl检测缓冲液
用TopSeal密封板并用箔包裹。
注意：小体积容易蒸发，TopSeal是至关重要的。
在减光照条件下室温孵育2小时或37℃孵育1小时。
注意：如果在37℃下孵育，确保板在测量发光之前回到RT（在37℃温育后约15分钟，在37℃孵育应足够）。检测珠是温度敏感的。
使用标准α筛选设置在Fusion-α或Envision读板仪上分析发光。

IV。数据分析

数据应该归一化到由FBS控制引起的响应。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na 2 HPO 4，1.8mM KH 2 PO 4，10mM KH 2 PO 4， pH 7.4。
检测缓冲区
85.0％SureFire ^®反应缓冲液
14.2％SureFire ^®激活缓冲液*
0.4％受体珠
0.4％供体珠
*活化缓冲液应储存在4°C，但在此温度下会发生沉淀。使用前，加热至37°C，以确保所有溶解在使用前立即准备检测缓冲液。丢弃未使用的检测缓冲区。轻轻混合检测缓冲液。不要涡旋。
补充说明：裂解物可以储存在-20°C，并且以后检测到pERK1/2，但刺激后不超过2周。

参考文献

Koole，C.，Wootten，D.，Simms，J.，Valant，C.，Sridhar，R.，Woodman，O.L.，Miller，L.J.，Summers，R.J.，Christopoulos，A.and Sexton，P.M。 78（3）：456-465。