材料和试剂

5'-生物素化RNA（Sigma-Aldrich）
链霉抗生物素复合固体基质（Dynabeads M-280链霉亲和素）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：11205D）
蛋白酶抑制剂（Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets）（Roche，目录号：1697498）
10％甘油
非特异性竞争者tRNA（Baker酵母）（Sigma-Aldrich，目录号：R8759）
NuPAGE LDS样品缓冲液（Life Technologies，Invitrogen TM ）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
Bis-Tris-Gel（Life Technologies，Invitrogen TM ）
NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液（Life Technologies，Invitrogen TM ）
考马斯简单蓝色安全污渍（Life Technologies，Invitrogen TM ，目录号：LC6060）
碳酸二乙酯（DEPC）处理水
RNase抑制剂（RNasin）（Promega，目录号：N2611）
IGEPAL CA-630（NP-40替代品）（Sigma-Aldrich，目录号：I3021）
KCl
甘油
NP-40
EDTA
提取缓冲液（见配方）
H-BW解决方案（见配方）
BW解决方案（见配方）

设备

150毫米板
蛋白胶盒
轨道震荡器（J.P.SELECTA，目录号：Orbit 3000445）
微量离心管用磁粉浓缩机（DYNAL BIOTECH，Dynal MPC-S 120.20）

软件

Image Lab V3.0（Bio-Rad）

程序

使用与链霉亲和素缀合的固体基质连接的5'-生物素化的RNA来进行蛋白质结合特异性RNA的捕获。
使用含有10％Igepal（NP-40）洗涤剂的提取缓冲液从传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染的人Huh7细胞中提取蛋白质。然后将细胞裂解物离心以沉淀核并保存细胞质提取物。简言之，在150mm平板上生长的Huh7细胞用TGEV病毒感染。在感染后48小时，收获来自两个平板的细胞，并用500μl不含Igepal（NP-40）的提取缓冲液重悬于冰上。将细胞提取物在冰上孵育15分钟，然后将Igepal（NP-40）洗涤剂加入到细胞悬液中至终浓度为10％。通过涡旋将提取物混合，在冰上再孵育10分钟，并以最大速度离心2分钟以回收上清液。蛋白质提取物可以在-80℃下用10％甘油储存。
每个RNA结合测定使用60μl链霉抗生物素蛋白缀合的固体基质（10μgμl -1 ）。在结合RNA之前，用360μl溶液H-BW洗涤固体基质两次。所有洗涤都是通过翻转管进行的。不需要孵化时间。洗涤后，使用磁铁将固体基质与上清液分离。将管放在磁铁中1-2分钟。
将未结合RNA的固体基质上的蛋白质提取物预清除。通过在轨道振荡器中以12rpm的速度与60μl固体基质一起温育至少5h，每次在4°时预先清除在H-BW溶液中稀释的蛋白质提取物（每个RNA结合测定法500μg的总蛋白）三次C。用磁铁分离固体基质。将管放在磁铁中1-2分钟。每个预清洗孵育后弃去固体基质，并将上清液转移到含有60μl新固体基质的新管中。第三次预清除后，保留上清液进行RNA结合（步骤7）
RNA固定在链亲和素固体基质上。对于每个RNA结合测定，使用60μl固体基质。以前，固体基质用最小体积的60μlBW溶液洗涤两次。然后，将链霉抗生物素蛋白基质与60μlBW溶液中的生物素化RNA（8μg）在室温下孵育30分钟。
将固体基质上固定的RNA作为最小体积用60μlH-BW溶液洗涤两次。将管置于磁铁中后，取出洗涤溶液。
RNA蛋白结合。加入固定化的RNA，将500μg预先清除的蛋白质提取物（来自步骤4）重新悬浮于H-BW溶液和不同量的非特异性竞争剂tRNA（0.5或1.25μgtRNAsμg -1蛋白）。在4℃和12rpm的速度下，在轨道振荡器中将混合物孵育过夜。样品的总体积为180μl（固体基质体积的三倍），由120μl预清蛋白提取物，25μltRNA和35μlH-BW组成。所有溶液在DEPC-水中，在0.4U /μlRNA酶抑制剂存在下制备，以使RNA降解最小化。
将管置于磁铁中，除去含有非结合蛋白的上清液。用120μlH-BW溶液洗三次
用补充有DTT 100mM的NuPAGE LDS样品缓冲液在室温下洗脱与固定的RNA结合的蛋白质10分钟。
通过与NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液电泳，结合RNAs的蛋白质在NuPAGE 4-12％Bis-Tris-Gel中解析。最后凝胶用考马斯Simply Blue Safe Stain染色。图像采用Image Lab V3.0。

食谱

提取缓冲区
2.5 mM Hepes pH 7.9
2.5 mM KCl
25μMEDTA
0.25 mM DTT
蛋白酶抑制剂：将一片稀释于25ml提取缓冲液中添加Igepal（如果需要）至最终浓度为10％。
H-BW解决方案
50 mM HEPES pH 7.9
150 mM KCl
5％甘油
0.01％NP-40
BW解决方案
5 mM Tris HCl（pH 7.5）
1 mM EDTA
1 M NaCl

致谢

这项工作得到了西班牙科学与创新部（BIO2010-167075）和欧洲共同体第七框架计划（FP7 / 2007-2013）在项目PoRRSCon（EC授权协议245141）下的资助。 L.M.和P.A.M.-G. 获得了西班牙科学与创新部（BES-2011-043489和BES-2008-001932）的前瞻性奖学金。我们衷心感谢C. M. Sanchez和M. Gonzalez的技术援助。

参考

Mateos-Gomez，PA，Morales，L.，Zuniga，S.，Enjuanes，L.and Sola，I.（2013）。87（1）：177-186。