材料和试剂

I. 荧光染料：

2'，7'-双 - （2-羧乙基）-5-（和-6） - 羧基荧光素（BCECF，AM）（Invitrogen，目录号：B-1170; TEFLabs，目录号：0062）
钾结合苯并呋喃间苯二甲酸酯乙酰氧基甲基酯（PBFI，AM）（Life Technologies，Invitrogen ，目录号： P-1267MP; TefLabs，目录号：0021）

II。其他材料：

Pluronic F127（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：P-3000MP; Teflabs，目录号：2510）}
摇瓶霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G5002）
1/2 MS平板，含有0.8％蔗糖，0.8％琼脂，pH 5.7，用于幼苗萌发和生长
1/10强度的MS培养基（不含蔗糖），用于装载染料
非选择性拟南芥种子
注：此方法针对拟南芥进行了优化。
小培养皿（35mm×10mm），小玻璃烧杯（体积10ml或更小）或其他用于幼苗孵育的小容器。 Eppendorf管将工作，但是当从这些管中添加或移除幼苗导致损伤时应该注意。我们优选具有较大开口的容器以更容易接近幼苗。
注意：对于PBFI装载，建议使用无菌培养容器，因为培养时间长。
微孔胶带（3M，目录号：1530-1）
染料加载介质（参见配方）
BCECF的原位校准缓冲区
用于PBFI的原位校准缓冲区（参见配方）

设备

具有适当滤光片的共聚焦或落射荧光显微镜（关于染料的光谱特性见下文）

软件

开源软件ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html）

程序

I. 幼苗生长

春季无菌种子在无菌水中3 天在4°C 。根据以下方案将种子灭菌。在几个Eppendorf管中，大约等分100个种子，而不关闭盖子，放入干燥罐中。在相同的干燥罐中，加入30毫升漂白到一个小烧杯，非常小心地加入1毫升浓HCl的漂白剂，同时在通风橱工作。使用干燥器盖，以防止可能的飞溅。关闭盖子立即并确保它是气密的。离开3小时。打开在清洁工作台，并谨慎吸入任何烟雾，因为这些都是危险。离开房间15分钟。在清洁时关闭管板凳。种子现在灭菌并且可以通过添加无菌来春化水。
在干净的长凳上播种无菌种子。无菌移液管尖端的切割端足够大以允许吸入的种子通过。
注意：使用Micropore胶带代替石蜡膜密封板有助于减少板中的冷凝。
地点板与种子，垂直在生长室22℃16小时光照。垂直板中生长的幼苗旨在使损伤最小化幼苗在将它们移出镀层并进入染料加载时船舶
种植幼苗，直到子叶充分膨胀但在真叶出现（约4天）之前幼苗长约1厘米
幼苗现在准备用于染料加载。

II。染料加载

在染料加载中制备10μMBCECF或20μMPBFI 并加入0.02％Pluronic F-127。轻轻地，但彻底地混合。通常0.5ml染料加载培养基足以孵育约10株幼苗，取决于所用的培养容器。小 10毫升烧杯或12孔培养皿对此工作良好注意：考虑到乙酰氧基甲基酯（AM）染料对水解的敏感性，使用新鲜染料原料至关重要。我们储存我们的染料在-20℃下在带有二氧化硅干燥剂的暗密封容器中等分试样珠子。
用镊子轻轻拿起幼苗下子叶和置于染料加载培养基中。无菌条件不是必要的。应注意不要损坏幼苗特别是对于用PBFI染料负载。我们观察到处理不良导致覆盖根表面的许多根毛的破裂其中细胞质物质被PBFI强烈染色。染色外部根减少染料加载和创建一个强大的细胞外信号干扰加载到根皮质中的染料的成像细胞
在黑暗中在染料加载培养基中孵育幼苗在室温下在摇床上以非常低的速度（足够移动溶液，但不是幼苗）。
孵育幼苗加载BCECF 30分钟到1小时和18小时到20小时PBFI 注意：无菌条件是必要的，因为培养时间很长，并且在装载培养基中存在蔗糖。
小心用染料加载培养基洗涤幼苗以除去过量的染料（5分钟×2）。应注意防止幼苗损伤和破裂根毛（再次，它是PBFI加载的情况下的关键）。
幼苗现在可以成像。
注意：对于PBFI，我们发现难以测量其附近的根皮质细胞根尖，因为最接近尖端的根毛更容易破裂，导致外部荧光强烈染色的问题根上述B-2。使用PBFI的可靠测量在成熟区根皮质细胞和下胚轴的细胞。对于 BCECF，所有细胞类型的成像是可能的，因为这种染料加载容易。

III。成像和图像分析

BCECF
1. BCECF是一个双比例染料已被广泛用于测量细胞内各种生物系统中的pH（Swanson等人，2011; O'Connor and Silver，2007）。比例测量具有几个优点单发射或激发染料，因为它们较少受影响染料负载量或隔室体积的差异其中染料积聚。在拟南芥根细胞，BCECF 特别积累在大中心液泡，使其成为用于液泡pH测量的理想工具
2. 幼苗可以使用共聚焦或落射荧光显微镜成像。 BCECF是使用458和488nm顺序激发。荧光发射针对530和550之间的两个激发波长中的每一个检测 nm。仔细调整成像设置，以说明的事实 BCECF的荧光强度将随着pH的升高而增加最好在类似的动态范围内检测荧光。避免过饱和，因为这将低估荧光强度并在pH测量中产生假象。考虑到这一点一些用于荧光显微镜的光源，例如氩气激光器或汞弧灯需要在它们之前开启一段时间发射稳定的非波动激发光。 20倍的目标是足以收集许多皮质细胞的图像。根和下胚轴细胞染色更容易并且比芽组织更容易成像。
  注意：不同的细胞类型和组织可以具有不同的液泡pH值（Bassil等人，2011）。
3. 图像分析可以使用开源软件ImageJ。
4. 一个在进行之前需要对每个图像进行背景校正与荧光强度值的计算。图片是使用减法背景校正背景荧光功能（在"处理"下拉菜单中找到）。说明对于这种类型的背景校正，可以在这里找到：
  （ http：//imagejdocu.tudor。 lu/doku.php？id = gui：process：subtract_background& s [] = rolling& s [] = ball ）
  它可能需要尝试不同的半径设置才能获得合理必须根据经验的质量从质量评估的价值校准曲线（见下文）。一般规则是获得校准曲线，其具有比率范围（即校准曲线的斜率）将足够大以允许确定pH的小变化（a 3 推荐比值在5.2-7.6的pH范围内增加一倍这里应该足够了）。校准曲线的效用取决于大大取决于收集的图像的质量，因此必须是经验。背景校正可以极大地影响使用不同背景时必须记住的比值校正修正参数。
5. 从每个背景校正图像，从中获得积分像素密度值 ImageJ的"测量"功能（在分析菜单下）。取决于设置，可能需要首先设置要包括的测量值 "集成密度"，可以通过"设置测量" 命令，也在"分析"菜单中。对于每个图像（即 488 nm和458 nm），将获得单个"积分密度"测量。的测量可以从ImageJ输出复制并粘贴到Excel中用于进一步计算。对于计算，积分密度 488 nm激发图像的值除以Integrated Ex458nm图像的密度。这对于不同的对重复的图像以获得平均比和标准偏差来确定治疗样本之间的统计显着性
6. 通常从中收集10-20个图像的平均值的比值约20个幼苗并且将包括6-10个皮质细胞每个图像。
PBFI
1. PBFI也是具有双激发（360nm& 380nm）和高于500nm的发射的比例染料。一般来说，采用类似的方法收集和校正装载PBFI的根细胞的图像，除了成像设置是激发360nm和收集高于500nm的发射，激发380nm和收集也在500nm以上的发射。
2. 图像处理与上述对于III-1 c-f以上的BCECF的描述相同。

IV。原位校准

BCECF
1. 为了获得校准曲线，孵育染料加载的幼苗在每个pH校准缓冲液（见配方2）中不超过 15-20分钟。将幼苗小心地放置在显微镜载玻片上大约100μl染料，并如上所述立即成像
2. 的可以将每种pH温育的比率对pH作图以获得校准曲线。一个S形回归（Boltzmann函数）可以拟合以描述校准曲线并计算随后的来自描述曲线的方程的pH值。
PBFI
1. 通过在含有不同K on +浓度的PBFI原位校准缓冲液中孵育装有染料的幼苗，进行PBFI装载的幼苗的原位校准。

食谱

染料加载介质
1/10强度MS
5mM MES pH5.7 0.5％蔗糖注意：pH可以用KOH调节用于BCECF负载，但这将干扰PBFI染料负载。以后的pH值可以用BTP调整。
BCECF的原位校准缓冲区
50mM乙酸铵 50mM Mes-BTP（pH 5.2-6.4）或50mM-HEPES-BTP（pH 6.8-7.6）
通常6或7个缓冲液足以覆盖pH 5.2至7.6的范围
PBFI的原位校准缓冲区
染料加载介质
2μM激肽素应制备含有0-100mM KCl范围的不同溶液，通常7种溶液（0,10,20,40,60,80和100mM KCl）就足够了。重要的是要注意，由于组织已经包含一些K，所以不能在'0mM K ⁺'进行K ⁺的原位校准⁺。在这种情况下，测量将低于校准曲线的下限，并且还需要进行体外校准曲线。

致谢

该方案部分地由Krebs等人（2010）和Halperin等人（2003）修改。这项工作是由国家科学基金会（MCB-0343279; IOS-0820112）和威尔W.莱斯特加利福尼亚大学捐赠。它是致力于斯蒂芬·哈尔佩林谁悲剧和意外地去世。

参考文献

Bassil，E.，Tajima，H.，Liang，Y.C.，Ohto，M.A.，Ushijima， Nakano，R.，Esumi，T.，Coku，A.，Belmonte，M。和Blumwald，E。（2011）。拟南芥 Na ⁺/H < sup> + 反转录物NHX1和NHX2控制液泡pH和K ⁺稳态以调节生长，花发育和繁殖。 9）：3482-3497。
Halperin，S.J。和Lynch，J.P。（2003）。盐度对细胞溶质Na ⁺和K ⁺在使用荧光染料SBFI和PBFI的体内测量中测定。 54 （390）：2035-2043。
Krebs，M.，Beyhl，D.，Gorlich，E.，Al-Rasheid，K.A.，Marten，I.，Stierhof，Y.D.，Hedrich，R。和Schumacher，K。拟南芥 V-ATPase在tonoplast上的活性是有效营养储存所必需的但不能用于钠积累。美国国家科学院院报107（7）：3251-3256。
O'Connor，N.和Silver，R.B。（2007）。比率成像：测量细胞内Ca 2+和pH的实际考虑活细胞。 Methods Cell Biol 81：415-433。
Swanson，S.J.，Choi，W.G.，Chanoca，A.and Gilroy，S。（2011）。对 ^{2 +}的成像提供了，pH和活性氧簇。在植物中使用荧光探针。 Annu Rev Plant Biol 62：273-297。