材料和试剂

硝基蓝四唑（NBT）（Sigma-Aldrich，目录号：N6876）
核黄素（Sigma-Aldrich，目录号：R4500）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
KCN（Sigma-Aldrich，目录号：60178）
（Sigma-Aldrich，目录号：349887）。< br />
NBT解决方案（参见配方）
研磨缓冲器（参见配方）
核黄素溶液（见配方）
KCN解决方案（参见配方）
解决方案（参见配方）。

设备

灯箱（白光）
离心机（Heraecus，Biofuge fresco）
蛋白凝胶盒

程序

拟南芥细胞提取物制备
1. 拟南芥幼苗在23℃，16小时光照下生长 60-100μmolm -2 -S sup -1 -1 。收集九天的幼苗并称重
2. 幼苗用冰冷的研磨缓冲液（组织重量/缓冲液体积= 1mg /3μl）匀浆。
  请注意，在所有提取过程中，组织和提取物应保持在4°C 。
3. 在4℃下以16,000×g离心10分钟
4. 上清液是所得的细胞提取物，并且通过Bradford方法（1976）定量蛋白质的量。
SOD活性染色
1. 将蛋白质或细胞提取物（15至25μg）在4℃下进行10％天然PAGE
2. 用蒸馏水洗涤凝胶3次。
3. 在黑暗中与NBT溶液孵育，在室温（RT）下摇动15分钟
4. 倒出NBT溶液，用蒸馏水洗涤凝胶3次。
5. 与核黄素溶液在黑暗中孵育15分钟，在室温摇动
6. 倒出核黄素溶液，用蒸馏水洗涤凝胶3次。
7. 凝胶在室温下用白光盒照射10-15分钟。在照明期间，将凝胶浸入薄层蒸馏水以避免干燥凝胶
8. 在光下暴露，核黄素减少，然后导致O 2 - 的产生。 NBT还原O 2 - 形成甲an，深蓝色沉淀。富集的SOD活性清除O 2 - 以防止其形成甲an，因此，白色SOD活性带出现在蓝色背景
不同SOD物种的鉴定（图1）
1. KCN处理：KCN仅抑制CuZnSOD活性所有程序与SOD活性染色过程相同，只是在核黄素溶液中加入KCN至最终8mM。
2. H 2 O 2处理：H 2 O 2抑制CuZnSOD和FeSOD活性。
  在天然PAGE和在SOD活性染色过程的NBT染色之前，用8mM H 2 O 2 Sub 2溶液在室温下振摇将凝胶浸泡30分钟。用蒸馏水洗涤凝胶3次，并遵循剩余的SOD活性染色过程。

图1.拟南芥中的SOD活性验证。 KCN是CuZnSOD活性的抑制剂，而H sub 2 O _{>抑制CuZnSOD和FeSOD活性。任何一种处理都不会抑制MnSOD活性。}

食谱

研磨缓冲器
150mM Tris（pH7.2）
NBT解决方案
0.1％NBT溶于蒸馏水中。
在4°C下储存在暗处
核黄素溶液（使用前新配制）
28μM核黄素和28mM TEMED在0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中
2 N KCN溶液
KCN在蒸馏水中。储存于4°C。
8mM H 2 O 2溶液（使用前新鲜制备）
将27μlH 2 O 2 Sub（35％）加入到30ml 0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中。

参考文献

Bradford，M. M.（1976）。一种快速灵敏的微克定量方法使用蛋白染料结合原理的蛋白质的量。 Anal Biochem 72：248-254。
Kuo，W.，Huang，C. H.，Liu，A. C.，Cheng，C. P.，Li，S. H.，Chang，W. C.，Weiss，C.，Azem，A.and Jinn，T.L。 CHAPERONIN 20介导铁超氧化物歧化酶（FeSOD）活性，而不依赖于其共伴侣作用，拟南芥叶绿体。 New Phytol 197（1）：99-110。