材料和试剂

胰蛋白酶：工作溶液是0.5％胰蛋白酶-0.2％EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：15400-054）
NaH 2 PO 4（Kanto，目录号：37239-01）
（化学品，目录号：37240-01）。
酒精
Poly/Bed 812（电子显微镜科学，目录号：14900）
Araldite 502（电子显微镜科学，目录号：10900）
十二碳烯基琥珀酸酐（DDSA）（TAAB，目录号：D025）
DMP-30（电子显微镜科学，目录号：13600）
环氧丙烷（Merk，目录号：S4912527-745）
注意：有毒，需要小心处理并在使用后收集。
注射器
滴管
网格（200目）（TAAB）
0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）（参见配方）
多聚甲醛（PB中4％）（Bionovas，目录号：AP0130-0500）（参见配方）
四氧化锇（1％在PB中）（电子显微镜科学，目录号：51007）（参见配方）
注意：有毒，需要小心处理并在使用后收集。
Epon（见配方）
Toluidune Blue（Sigma-Aldrich，目录号：NO202-146-2）（参见Recipes）
乙酸铀（Art，目录号：8473）（参见配方）
柠檬酸铅（TAAB，目录号：L003）（参见配方）

设备

Eppendorf管
离心机
真空干燥箱
金刚石刀（Diatome）
Ultracut（Leica）
TEM（HITACHI，型号：H-7100）

程序

注意：在这个过程前一天，将所有的滴管和注射器放入60℃的烘箱中，以除去所有填充物中的所有水。

处理后，用0.5％胰蛋白酶-EDTA收集细胞（1×10 6），并通过离心机（300×g离心管）在eppendorf管中用0.5ml 0.1M磷酸盐缓冲液（PB）/em，5分钟）。
加入0.5毫升多聚甲醛（4％，在PB中）将细胞在室温（RT）下固定至少30分钟（或储存细胞在4℃长期储存）。
通过离心机（300×g，5分钟）用0.5ml 0.1M PB洗涤细胞3次。
加入0.5毫升四氧化四锇（1％在PB中）到管中，并在室温下孵育细胞1小时。
通过离心机（300×g，5分钟）用0.5ml 0.1M PB洗涤细胞3次。
加入0.5ml 70％酒精5分钟两次，离心（300×g，5分钟），脱水细胞→除去酒精。
加入0.5ml 85％酒精5分钟两次→离心（300×g，5分钟）脱水细胞→除去酒精。
加入0.5ml 95％酒精5分钟，三次离心细胞→离心（300×g，5分钟）→除去酒精。
脱水细胞，加入0.5ml 100％酒精10分钟，5次→离心（300×g，5分钟）→除去酒精。
注意：从第10步开始，所有材料都应使用60°C烤箱。
将0.5ml环氧丙烷加入管中，并在RT下温育3分钟两次→离心（300×g，5分钟）→除去环氧丙烷。
向管中加入1ml（环氧丙烷:Epon = 1:1）并在室温下孵育1小时→离心（300×g，5分钟）→除去环氧丙烷：Epon。
将1ml纯Epon加入管中，并将样品放入真空干燥炉中，在室温下真空1小时。→除去Epon。
将1ml纯Epon加入管中，在室温下真空1小时。→除去Epon
将1ml纯Epon加入试管中，在室温下真空过夜
将管放入60℃烘箱至少48小时
修剪 - 移除块的边缘。
使用金刚石刀获得厚切片（1μm）Ultracut→将厚切片放在载玻片上，用0.5％甲苯胺蓝染色约40秒至1分钟（直到边缘干燥）→用水洗涤1分钟→观察在显微镜下找到细胞
一旦我们发现细胞在厚的部分，改变Ultracut的厚度得到薄部分（65-70 nm）。
将薄片放在网格上（一个网格上3-4个部分）。
用醋酸铀和柠檬酸铅依次染色3分钟
用水清洗网格1分钟，让它们完全干燥
从相同壮观的TEM上的数码相机获取图像。

食谱

0.1M磷酸盐缓冲液（PB）
19ml 0.2M NaH 2 PO 4 4/v/v 81ml 0.2M Na 2 HPO 4水溶液
4％多聚甲醛
4％多聚甲醛在PB中的溶液
四氧化锇
1％的四氧化锇在PB中
Epon
使用注射器混合以下所有试剂以制造Epon Poly/Bed 812 10 ml
Araldite 502 6 ml
DDSA 18ml
DMP-30 0.7ml
Epon可以在4°C或-20°C下储存1-2周
甲苯胺蓝
0.5％甲苯胺蓝
1％硼酸钠/H 2 O 2 / 用0.22μM过滤器过滤
乙酸乙烯酯
在50％的乙醇中的饱和乙酸铀酰
柠檬酸铅
1％的H 2 O中的柠檬酸铅加入3滴10M NaOH（约0.5ml）

致谢

该协议改编自Chau和Lu（1996）和Lee等人（2012）。

参考文献

Chau，Y.P。和Lu，K.S.（1996）。在啮齿类动物的各种交感神经节中血微血管系统的差异渗透性。 Anat胚胎（Berl） 194（3）：259-269。
Lee，C.P.，Liu，P.T.，Kung，H.N.，Su，M.T.，Chua，H.H.，Chang，Y.H.，Chang，C.W.，Tsai，C.H.，Liu，F.T.and Chen， ESCRT机制由病毒性BFRF1蛋白募集至细胞核相关膜， em> Epstein-Barr病毒。 8（9）：e1002904。