I. 测量丙二醛

材料和试剂

硫代巴比妥酸（TBA）（Sigma-Aldrich，目录号：T5500）
三氯乙酸（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：T9159）
丙二醛（MDA）（BOC Sciences，目录号：542-78-9）

设备

离心机
分光光度计

程序

注意：实验在室温（RT）下进行，除了具体的指示。

将0.1g叶组织（具有相似的年龄，年轻的扩张叶可能更好）用液氮研磨成粉末，然后将粉末放入含有1ml 0.1％（w/v）TCA的管中，通过翻转管混合以均匀化叶组织
将匀浆样品以10,000×g离心10分钟，然后将上清液转移至新管中。
向上清液中加入4ml含0.5％TBA的20％TCA，充分混合
将混合物在95℃下煮沸15分钟，并在冰上快速冷却（TBA可与MDA相互作用，并在酸性缓冲液中形成红色化合物，因此MDA的含量可通过用分光光度计测量所得红色化合物的密度来计算高温可加速反应，低温可抑制反应）。
将混合物以10,000×g离心5分钟，然后将上清液转移到新管中。
为了产生标准曲线，制备MDA的连续浓度：1μM，2μM，5μM，10μM，20μM和50μM（每种稀释的体积取决于分光光度计的比色杯的尺寸）。
用分光光度计测量步骤6的标准样品在532nm的光密度，并使标准曲线得到消光系数（图1）。

图1. MDA
的标准曲线
测量来自步骤5的植物样品在532nm处的光密度，并根据标准曲线计算MDA的含量（Madhava Rao和Sresty，2000; Baryla等人，2000）。br/>

II。叶绿素的测量

材料和试剂

二甲基甲酰胺（DMF）（Sigma-Aldrich ，目录号：D4551）

设备

离心机
分光光度计

程序

注意：实验在室温下进行。

将0.1g叶组织用液氮研磨成粉末，然后用1ml 100％DMF匀化
将匀浆样品在10,000×g离心10分钟，然后收集上清液。
分别在664nm和647nm处测量上清液的光密度。
通过下式计算叶绿素a和叶绿素b的含量（Sibley等人，1996; Inskeep和Bloom，1985; Aono等人， em。，1993）：
[叶绿素a] = 12.7×A 664 - 2.79×A 647
[叶绿素b] = 20.7×A 647+ 4.62×A 664
[叶绿素a +叶绿素b] = 17.90×A 647+ + 8.08×A 664 <

III。测量脯氨酸

材料和试剂

磺基水杨酸（DingGuo，目录号：DS094）
脯氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：858919）
茚三酮（Sigma-Aldrich，目录号：151173）
乙酸（DingGuo，目录号：DS002）
正磷酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P2023）
甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：650579）
水合试剂（见配方）

设备

离心机
分光光度计

程序

注意：实验在室温（RT）下进行，除了具体的指示。

为了产生标准曲线，在3％磺基水杨酸中制备脯氨酸的连续浓度：1μM，10μM，50μM，100μM，150μM，200μM，300μM，每种稀释1ml。
每个500μl标准溶液在5ml管中加入500μl乙酸和500μl茚三酮试剂并煮沸45分钟，然后在冰中冷却30分钟。
向每个样品中加入等体积甲苯，振动1分钟，然后在1,000×g离心5分钟。
用分光光度计测量甲苯溶液在520nm处的光密度，得到标准曲线（图2）

图2.脯氨酸
的标准曲线
将0.5g植物样品用液氮研磨成粉末，然后用管中的2ml 3％磺基水杨酸匀化。
在5,000xg离心均质样品5分钟，然后收集上清液
将上清液作为步骤2和3处理，并测量作为步骤4的样品的光密度，然后使用来自步骤3的标准曲线计算脯氨酸的含量（Bates等人，1973; Lattanzioa et al 。，2009）。

食谱

水合试剂
将2.5g茚三酮连续加入到60ml冰乙酸和40ml 6M正磷酸盐中，然后在70℃下溶解。冷却后，试剂可以在4℃下储存在棕色瓶中不超过24小时

IV。测量可溶性糖

材料和试剂

乙醇（DingGuo，目录号：DS023）
葡萄糖（DingGuo，目录号：DS063）
蒽酮（SCRC，目录号：30015014）
H 2 SO 4（Sigma-Aldrich，目录号：339741）
硫脲（Amresco，目录号：M222）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
蒽酮试剂（见配方）

设备

离心机
分光光度计
振动器

程序

注意：实验在室温（RT）下进行，除了具体的指示。

为了产生标准曲线，对于每一浓度的葡萄糖溶液，使葡萄糖的系列浓度为1μM，10μM，50μM，100μM，150μM，200μM，300μM，5ml。
将50μl每种稀释的葡萄糖溶液与4.95ml蒽酮试剂混合，然后煮沸15分钟。
通过分光光度计测量620nm处葡萄糖标准品的光密度，以产生标准曲线
将0.1g干燥的样品用液氮研磨成粉末，然后在50ml管中以200rpm在振荡器中用2ml 80％乙醇匀化1小时。
以6000xg离心10分钟，然后将尽可能多的上清液转移到新的5ml管中。
加入等体积的氯仿，完全混合，然后以12,000×g离心10分钟。
将含水部分转移到新管中并重复步骤2和3以测量样品的光密度。可溶性糖的含量根据步骤3中制备的标准曲线计算（Mandre等人，2002; Jin等人，2007）。

食谱

蒽酮试剂
72％H <2> SO 4
500 mg/L蒽酮
10 g/L硫脲

V 。测量谷胱甘肽

材料和试剂

三氯乙酸（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：T9159）
聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）（Sigma-Aldrich，目录号：P6755）
2-氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇（TRIS）（DingGuo，目录号：DH350）
5,5-二硫代 - 双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）（DingGuo，目录号：DH499）
谷胱甘肽还原酶（GR）（Merck KGaA，目录号：359960）
谷胱甘肽（GSSG）（Solarbio，目录号：G8690）
反应溶液（参见配方）

设备

离心机
分光光度计

程序

注意：实验在室温（RT）下进行，除了具体的指示。

为了产生标准曲线，GSSG的连续浓度为：对于GSSG的每个稀释，0.5,1,2,5,10,20μM，2ml。
将100μl在步骤1制备的每种GSSG标准品加入到3ml反应溶液中并孵育15分钟。然后加入100mM DTNB至终浓度为10mM，并在25℃下孵育15分钟。
通过分光光度计测量每个样品在412nm处的光密度，并制作具有GSSG标准品浓度和每个GSSG标准品的光密度的函数的标准曲线。
将0.5g拟南芥叶在液氮中研磨
将样品与1ml提取物溶液匀浆，通过倒置管而完全混合。
将混合物在4℃以10,000×g离心10分钟，然后将上清液转移到新管中。
如步骤2所述处理100μl上清液，如步骤3所述在412nm处测量上清液的光密度，并根据标准曲线计算样品的GSSG含量。
将100μl上清液与含有10mM DTNB的3ml 500mM TRIS-HCl（pH 8.0）缓冲液混合，并在25℃温育15分钟。然后在412nm测量光密度。谷胱甘肽（GSH）含量通过与步骤3中描述的相同的标准曲线用下式测定：[GSH] = 2x [标准曲线]。
总谷胱甘肽含量= [GSH] + [GSSG]（Huang等人，2005; Chen等人，2011）

食谱

反应溶液
500mM TRIS-HCl（pH 8.0）缓冲液
GR（每3ml反应溶液1U） 1mM EDTA
3mM MgCl 2/
150μMNADPH
提取解决方案
0.1％TCA（pH 2.8）
1mM EDTA
1％（w/v）PVPP

致谢

该协议改编自Huang等人（2005）以及参考列表中提及的其他作品。

参考文献

Aono，M.，Kubo，A.，Saji，H.，Tanaka，K。和Kondo，N。（1993）。增强对转基因烟草的光氧化胁迫的耐受性谷胱甘肽还原酶活性。植物细胞生理学 34（1）：129-135。
Baryla，A.，Laborde，C.，Montillet，J.L.，Triantaphylides，C.and Chagvardieff，P。（2000）。评估脂质过氧化作为暴露于铜的植物的毒性生物测定。 Environ Pollut 109（1）：131-135。
Bates，L.，Waldren，R。和Teare，I.（1973）。快速测定水分胁迫研究中的游离脯氨酸。植物土壤 39（1）：205-207。
Chen，L.，Han，Y.，Jiang，H.，Korpelainen，H.and Li，C.（2011）。氮营养状态在云南杨中对镉的反应中诱发性别差异。 J Exp Bot 62（14）：5037-5050。
Huang，C.，He，W.，Guo，J.，Chang，X.，Su，P.and Zhang，L。（2005）。提高对抗坏血酸缺乏型拟南芥突变体中盐胁迫的敏感性。/a> J Exp Bot 56（422）：3041-3049。
Inskeep，WP and Bloom，PR（1985）。叶绿素a和B在n中的消光系数， n-二甲基甲酰胺和80％丙酮。植物生理学77（2）：483-485。
Jin，ZM，Wang，CH，Liu，ZP和Gong，WJ（2007）。生理和在土壤盐度和海水灌溉下对芦荟进行生态学特征研究。过程生物学 42（4）：710-714。
Lattanzio，V.，Cardinali，A.，Ruta，C.，Fortunato，I.M.，Lattanzio，V.M.，Linsalata，V.and Cicco，N。（2009）。次生代谢与牛至生长的关系（<牛>）芽培养物在营养应激下。 Environ Exp Bot 65（1）：54-62。
Madhava Rao，K.V.and Sresty，T.V。（2000）。木豆幼苗中的抗氧化参数（ Cajanus cajan （L.） Millspaugh）响应Zn和Ni应力。植物科学157（1）：113-128。
Mandre，M.，Tullus，H。和Kloseiko，J。（2002）。在苏格兰松林冠层中分离碳水化合物和生物量。 Naturforsch C 57（3-4）：296-302
Sibley，J.L.，Eakes，D.J.，Gilliam，C.H.，Keever，G.J.，Dozier，W.A.and Himelrick，D.G。（1996）。叶面SPAD-502米值，氮水平和可提取叶绿素用于红枫选择。 Hort Sci 31（3）：468-470。