材料和试剂

小鼠（4-7周龄）。作为阳性对照，您可以总是使用野生型小鼠并通过如所述的EGF处理诱导腺泡外植体的分化。根据您的应用，您可以使用转基因小鼠
McCoy's 5A培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M8403）
Waymouth'medium MB 752/1培养基（Genaxxon，目录号：C4119）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A4503）
大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）（Sigma-Aldrich，目录号：T6522）
胶原酶VIII型（Sigma-Aldrich，目录号：C2139）
80％EtOH
青霉素 - 链霉素（P/S）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
两性霉素B（不是关键的，例如来自Biochrom，目录号：A2610）
FCS（Life Technologies，Gibco ，目录号：10270）
牛皮提取物（BPE）（Life Technologies，Gibco ，目录号：13028-014）
胰岛素，转铁蛋白，硒，乙醇胺溶液（ITS-X）（Life Technologies，Gibco ，目录号：51500）
大鼠尾胶原I型（BD Biosciences，目录号：354236）
无菌10x PBS（BIOCHROM，目录号：182-50）
无菌dH 2 O 2/b
无菌1N NaOH，
rhTGFa（R& D systems，目录号：239-A）
mEGF（BD Biosciences，目录号：354010）
SBTI储备溶液（见配方）
胶原酶VIII储备溶液（见配方）
洗涤溶液（见配方）
0.1％培养基（Waymouth培养基）（Genaxxon，目录号：C4119）（参见配方）
30％培养基（Waymouth氏培养基）（Genaxxon，目录号：C4119）（参见配方）

设备

Stericups过滤器单元（EMD Millipore）
50ml Falcon管
组织培养皿（10mm）
6孔板
24或48孔板
解剖钳和剪刀
一次性手术刀
100μM细胞过滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352360）
注射器柱塞

程序

I. 在板凳上：

小鼠应该在4和7周龄之间。腺泡问题的隔离不适用于老年小鼠。因为时间是腺泡细胞活力的关键步骤，我们通常不会同时处理超过2只小鼠。
从一只小鼠可以获得约1,000个腺泡外植体。腺泡组织可以接种在例如48孔板的15个孔中，因此当通过10×目标物在孔中看到约30个腺泡外植体时，获得腺泡组织的差异性的obtimal denisty。如果密度太高，分化将需要更长时间，如果太低的腺泡细胞死亡。

将钳子和剪刀放入80％乙醇。
用异氟烷麻醉小鼠，通过颈椎脱臼处死小鼠，并尽可能快地切除胰腺（时间是关键的一步）。
将切除的胰腺放入含有冰冷无菌PBS的组织培养皿中

II。到目前为止，所有方案步骤应在无菌条件下进行。

在720×g（18℃）的离心步骤是关键步骤！

在罩中，将胰腺转移到含有10ml PBS的培养皿中
立即将胰腺放入具有5ml胶原酶VIII溶液的培养皿中（参见配方4），并用手术刀在2分钟内切割非常小的部分（直径小于1mm）的器官。向上和向下吸移纸巾。
孵育皿在37℃下10分钟。不时摇晃。
将样品转移到50毫升猎鹰。向上和向下移液3x溶液。
用10毫升洗涤液洗涤培养皿，转移到50毫升的猎鹰
离心机，720×g，5分钟，18℃
小心地清除上清液。
将沉淀重悬在5ml胶原酶VIII溶液中。放入培养皿。吸取组织上下。
在37℃孵育10分钟。不时摇晃。
吸取样品，并通过位于50ml falcon上的100μm尼龙细胞过滤器过滤
用注射器柱塞使组织片通过细胞过滤器。
注意：这一步很难描述，尝试用注射器柱塞通过过滤器按压组织而不施加剪切应力。您可能必须在手中优化此步骤。
用10毫升洗涤液洗涤网，仔细收集剩余的细胞
离心机，720×g，5分钟，18℃
小心地清除上清液。
在20ml洗涤溶液中吸出沉淀，并将溶液转移到新管中。不要上下吸入！
离心机，720×g，5分钟，18℃
将沉淀重悬在2ml培养基30％中，并将其转移到6孔培养皿的孔中。
检查显微镜下孤立的腺泡组织的质量。隔离是好的，如果你看到腺泡细胞簇（上皮外植体，形态是相同的在下图中的Ctr。），只有罕见的孤立的腺泡细胞游泳。有时损伤的腺泡细胞聚集在一起，用镊子去除这种粘性团块
让孤立的腺泡在孵育器（37℃，5％CO 2）中恢复60分钟。
同时用胶原预涂所需大小的细胞培养板（见下文）。计算步骤25所需的胶原蛋白 - 培养基混合物所需的体积。体积取决于您的应用。对于48孔板计算为100μl体积/孔或对于8孔腔室载玻片计算为80μl体积/孔。通常，您将从一个野生型小鼠获得的腺泡外植体种植在48孔板的15个孔中。在这种情况下，您需要100μlx 15/2 = 750μl胶原和100μlx 15/2 = 750μl培养基0.1％。
从板中收集腺泡悬浮液，并将其转移到新鲜的15毫升管
离心acinar悬浮液，720×g/min，5分钟，18℃
小心吸出上清液。
将沉淀重悬于胶原和0.1％（1:1体积/体积）培养基的混合物中
将腺泡/胶原 - 培养基悬浮液混合物吸入板中的每个涂覆的孔中（至少一式三份）。对于典型的48孔实例，您在15个孔中移取100μl的混合物
等待胶原凝固（约30分钟）
加入一些更多的胶原（100微升/孔的48孔板）。当您将进行免疫荧光作为下游应用时，您可以跳过此步骤。等待直到凝固（约30分钟）
向每个孔中加入含/不含所需补充剂的培养基0.1％。通常对于48孔板为400μl/孔
为了诱导腺泡外植体的转分化，在第1-3天向培养基中加入TGFα（10ng ml -1 -1）或EGF（25ng ml -1 -1）至培养基0.1％ -5，其中第1天是隔离日。
注意：
1）我们通常量化野生型腺泡外植体在EGF处理后第5天的转分化（图1）。
2）培养可以保持到第8天。对于更长的培养时间，你必须将腺泡外植体重新投入到新鲜胶原蛋白中，因为培养物变成酸性，胶原蛋白分解。

III。大鼠尾胶原I的胶凝方法，2.5mg ml -1 sup

置于冰上：胶原，无菌10x PBS，无菌水，无菌1N NaOH，falcon管。将所有试剂置于冰上。
用下式计算所需的胶原蛋白的总量（最终浓度为2.5mg ml -1 -1）：（最终体积×2.5）/（瓶中的胶原浓度）。对于48孔板，您需要100/120μl胶原层/孔，对于8孔室玻片，需要80μl胶原层/孔。
在冰上用以下体积的10×PBS：（最终体积）/10制备管
将以下体积的1N NaOH加入到含有10×PBS：（要添加的体积胶原）×0.023ml的试管中。
将10×PBS/1N NaOH加入以下体积的无菌冰冷水：（最终体积） - （体积胶原） - （体积10×PBS） - （体积1N NaOH）。
混合管中的内容物并保持在冰上
添加计算体积的胶原蛋白和混合。放在冰上（稳定2-3小时），直到准备使用。
用胶原涂覆组织培养皿（使用24/48孔用于定量转分化，蛋白质或RNA提取，或使用8孔腔室载玻片用于随后的染色应用）。
允许胶原在37℃（约30分钟）固化
注意：下游应用包括免疫荧光，蛋白质提取，RNA提取和细胞毒性测定。

图1.腺泡外植体在第5天的实施例。分离来自野生型小鼠的腺泡外植体，并如所述在胶原中培养5天。 Ctr（仅培养基）：典型的腺泡外植体由几个腺泡细胞的球体组成。 EGF：在25ng/ml EGF细胞簇存在下，获得更扁平的形态，并分化成以几个细胞为衬里的腔（箭头）为特征的管状结构。

食谱

SBTI储液
10 mg/ml在McCoy培养基中，储存在-20℃。
（可选）胶原酶VIII储备液
9.6mg/ml在McCoy培养基（未完全溶解）中，储存在-20℃
洗涤溶液（40ml /小鼠）
McCoy的媒介
0.1％BSA（无菌过滤） 0.2 mg/ml SBTI（库存1:50）
胶原酶VIII溶液（10ml /小鼠）
McCoy的媒介
0.1％BSA（无菌过滤） 0.2 mg/ml SBTI（库存1:50）
1.2mg/ml胶原酶VIII（临界步骤，在使用前添加胶原酶，稀释胶原酶VIII储备液1:8）
0.1％培养基
Waymouth的媒介
0.1％BSA（无菌过滤） 0.2 mg/ml SBTI（库存1:50）
P/S 1：200（可选，不需要短期文化）
0.25μg/ml两性霉素B（抗真菌剂，可选）
ITS-X 1：100
BPE：50μg/ml（按批次浓度稀释）（等分试样，-20℃）
0.1％FCS
30％培养基
0.1％培养基
30％FCS

致谢

用于来自成年鼠胰腺的腺泡上皮外植体的这种方案通过修改先前公开的方案来建立（（Lisle和Logsdon，1990; Githens等人，1994; Means& ，2005）。这项工作得到了Wilhelm Sander Stiftung（2010.021.1）的资助。

参考文献

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Githens，S.，Schexnayder，J.A.，Moses，R.L.，Denning，G.M.，Smith，J.J.and Frazier，M.L。（1994）。小鼠胰腺腺泡/肾小管组织产生上皮细胞培养物，其形态，生物化学和功能上无法区分小叶间导管细胞培养物。 In Vitro Cell Dev Biol Anim 30A（9）：622-635。
Heid，I.，Lubeseder-Martellato，C.，Sipos，B.，Mazur，PK，Lesina，M.，Schmid，RMand Siveke，JT（2011）。胰腺癌小鼠模型中Rac1的早期需求。胃肠病学 141（2）：719-730。 e717。

Lisle，D.，Ratcliffe，J.F.，Faoagali，J。和Cherian，S。（1990）。开启后储存的造影剂的细菌污染。 Br J Radiol 63（751）：532-534。

Means，A.L.，Meszoely，I.M.，Suzuki，K.，Miyamoto，Y.，Rustgi，A.K.，Coffey，R.J.，Wright，C.V.，Stoffers，D.A。和Leach，由腺泡细胞转分化和巢蛋白阳性中间体的产生介导的胰腺上皮可塑性。 em> Development 132（16）：3767-3776。