材料和试剂

CO 2独立培养基（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：18045054）
Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）（Sigma-Aldrich，目录号：I3390）
胎牛血清（Hyclone/PAA，目录号：sv-143-03）
青霉素链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P11-010）
谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
GM-CSF（10ng/ml）（Peprotech，目录号：315-03）
EDTA（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15575-038）}
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：43813）
ULTRA片剂蛋白酶抑制剂混合物溶液（Roche，目录号：05892791001）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S-7653）
Tris pH 7（Sigma-Aldrich，目录号：T-1503）
NP40（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I-5513）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S79-03）
RIPA（Pierce Antibodies，目录号：89900）
抗体：
EEA1（Abcam，目录号：ab2900）
TfR兔血清（自制）
LAMP1（Abcam，目录号：ab62562）
Rab7（Abcam，目录号：ab126712）
1x PBS（请参阅配方）
RIPA缓冲液（参见Recipes），补充有2mM DTT和1x完全ULTRA蛋白酶抑制剂混合物片剂
骨髓衍生的树突细胞培养基（BMDC）（参见Recipes）
均质缓冲液（HB）（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）

设备

水浴
磁珠（Dynal，Dynabeads M-280链霉亲和素）
用于eppendorf的磁性支架（Dynal，目录号：R670001）
22g针（Terumo，目录号：NN-2238R）
1ml注射器（Terumo，目录号：S * 025E1）
离心机

程序

用1x PBS-5mM EDTA（37℃下10分钟）分离骨髓来源的树突细胞（BMDC）。
用PBS洗涤细胞两次，在367×g离心10分钟
将细胞重悬在CO 2独立培养基中的15ml falcon管（7.5×10 7个细胞/750μl）中。
向细胞中加入磁珠（比率：6.5×10 5珠/μl）。
在30℃的水浴中孵育20分钟。
将水浴温度升至37℃，并将细胞保持20分钟（脉冲）
通过加入10ml冷冰1x PBS-0.1％BSA停止反应，并在340℃下在4℃离心10分钟。
重复步骤7 3次。
将细胞重悬于3ml BMDCs培养基中，并将细胞分入15ml的3个falcon管（每个1ml细胞）中。
加入10ml冷PBS-0.1％BSA fort = 0（脉冲）并置于冰上，将其他试管在37℃下放置不同的时间（追踪，40分钟和100分钟）。
T = 0对应于早期吞噬体（20分钟的脉冲）; t = 60分钟对应于中间吞噬体（脉冲的20分钟+追踪的40分钟），t = 120分钟对应于吞噬溶酶体（脉冲的20分钟+追踪的100分钟）。
在追踪结束时，将细胞在463×g离心10分钟。
现在，在冰上执行以下步骤。
在冰冷的HB缓冲液中洗涤细胞。
将细胞重悬在1ml HB缓冲液中。
使用1ml注射器和22g针打破细胞。你需要大约30次冲洗来打破细胞。在显微镜下检查细胞破碎（约70％的细胞应该死掉）。
将破碎的细胞转移到冷eppendorf管中，并将eppendorf管放在冰上的磁力架上。
离开5分钟; 用薄尖吸出上清液。保持上清液（在冰上）。
用1ml PBS-0.1％BSA小心地洗涤珠子，并在步骤16重复8次
重悬在裂解缓冲液或RIPA缓冲液（50微升）的珠子，冰上15分钟
以13,400×g离心15分钟并冷冻上清液。
吞噬体准备使用，并且可以使用一组抗体（EEA1或TfR用于早期标记，LAMP1或Rab7用于晚期标记，参见图1）检查其纯度。

图1.在20,60和120分钟后，用磁珠纯化来自BMDC的吞噬体。通过SDS-PAGE分离5μg蛋白质。晚标记（LAMP1）通过免疫印迹显示

食谱

1x PBS
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
8mM Na 2 HPO 4
1.46mM KH 2 PO 4>/
RIPA缓冲区
50mM Tris pH7.5 150mM NaCl 1％NP40
0.5％脱氧胆酸钠盐 20 mM EGTA
骨髓衍生的树突细胞培养基（BMDCs）
IMDM补充
10％胎牛血清
1％青霉素链霉素 1％谷氨酰胺 10ng/ml GM-CSF
均质缓冲液（HB）
8％蔗糖 3mM咪唑 2mM DTT
完全的1x ULTRA片剂蛋白酶抑制剂混合物溶液（在2ml H 2 O，25x中溶解1片）
裂解缓冲液
150mM NaCl 50mM Tris pH 7
完全的1x ULTRA片剂蛋白酶抑制剂混合物溶液（1片，10ml） 0.5％NP40
2mM MgCl 2/

致谢

该协议改编自Cebrian等人（2011）; Maschalidi等人（2012）; 和Mantegazza等人（2012）。

参考文献

Cebrian，I.，Visentin，G.，Blanchard，N.，Jouve，M.，Bobard，A.，Moita，C.，Enninga，J.，Moita，LF，Amigorena，）。 Sec22b调节树突细胞的吞噬体成熟和抗原交叉表达。 em> 147（6）：1355-1368。
Maschalidi，S.，Hassler，S.，Blanc，F.，Sepulveda，FE，Tohme，M.，Chignard，M.，van Endert，P.，Si-Tahar，M.，Descamps，D.and Manoury，B 。（2012）。天门冬酰肽酶内肽酶通过TLR7激活来控制抗流感病毒免疫反应。 Pathog 8（8）：e1002841。
Mantegazza，A.R.，Guttentag，S.H.，El-Benna，J.，Sasai，M.，Iwasaki，A.，Shen，H.，Laufer，T.M.and Marks，M.S.（2012）。衔接蛋白-3在树突状细胞中促进噬菌体toll样受体信号传导和抗原呈递到CD4（+ ）T细胞。 mmunity 36（5）：782-794。