材料和试剂

含有生长的白色念珠菌菌落的平板
500ml0.22μm过滤器（Corning，目录号：431118）
铝箔
细菌蛋白胨（BD Biosciences，目录号：211677）
细菌酵母提取物（BD Biosciences，目录号：212750）
细胞刮刀（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353085）
Difco葡萄糖（BD Biosciences，目录号：215530）
戊二醛（ Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
硝酸铅（PbNO 3）（Electron Microscopy Sciences，目录号：17900）
MOPS（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP308）
4％四氧化锇（Electron Microscopy Sciences，目录号：19140）
parafilm
多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
环氧丙烷（Electron Microscopy Sciences，目录号：20410）
RPMI 1640（Sigma-Aldrich，目录号：R6504）
二水合三甲基膦酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：C0250）
氯化钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S671-3）
柠檬酸钠（Electron Microscopy Sciences，目录号：21140,500gm）
氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：59223C）
无水磷酸氢二钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP332-500）
磷酸二氢钠一水合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：S369-500）
Spurr树脂试剂盒（Polyscience，目录号：01916-1）
尿苷（Sigma-Aldrich，目录号：U3750）
乙酸乙酯（Electron Microscopy Sciences，目录号：22400）
YPD +尿苷（参见配方）
RPMI + MOPS（请参阅配方）
1x PBS（请参阅配方）
固定剂（见配方）
雷诺铅柠檬酸菌（参见食谱）

设备

15ml锥形管（Corning，目录号：CLS430055）
6孔聚苯乙烯板（Grenier Bio-one，目录号：657160）
血细胞计数器
以可调温度和速度摇动培养箱
具有训练有素的显微镜的透射电子显微镜设备

程序

在15ml锥形管中5ml的YPD +尿苷培养物接种在2至10天龄的板上生长的白色念珠菌的单个菌落（菌落的年龄可以基于生长而变化特定应变速率）。大多数< em>念珠菌菌株和物种在该培养基中生长良好，但如果另一种培养基通常用于特定菌株，则可以代替。
将接种物在30℃和200rpm下温育过夜
过夜培养物的细胞浓度通过血细胞计数器上的细胞计数来确定
在RPMI + MOPS中将接种物稀释至1×10 6个细胞/ml
将1ml稀释的导管加入6孔板的每个孔中注意：接种物扩散覆盖整个井底。
6孔板在30℃温育60分钟而不摇动
然后从每个孔中轻轻取出接种物，以便不刮除新形成的生物膜
向每个孔中轻轻加入1ml新鲜的RPMI + MOPS培养基
将6孔板包裹在石蜡膜和铝箔中，并在37℃和50rpm下孵育24小时注意：非常重要的是，生物膜不会在50 rpm以上摇动，因为这会从板底移出生长的生物膜。
24小时后，轻轻地除去培养基，以不干扰生物膜，并用1ml新鲜的RPMI + MOPS替换。
注意：倾斜6孔板并轻轻地将移液管尖端放在孔的角落，有助于防止对脆弱的生物膜造成太大的破坏。
6孔板如前所述重新包装，并在37℃和50rpm下再培养24小时
在第二个24小时温育后，从孔中除去培养基，并将生物膜在1ml的1×PBS中轻轻洗涤1次。重要的是在PBS中慢慢吸取，以免干扰精细的生物膜。 PBS洗液可以在添加到生物膜后立即除去。
收获每个生物膜在2毫升1×PBS，并存储在15毫升锥形管注意：收获最好是通过将1ml PBS加入孔中，并用塑料刮刀刮去生物膜，并将生物膜添加到锥形管中。然后用第二个1ml PBS重复该过程以收集任何残留物。
弃去上清液，将沉淀重悬于2ml固定剂中
管可以储存在4℃，直到准备好由训练的透射电子显微镜成像。建议试管不要储存超过几天。
以下步骤是由训练有素的透射电子显微镜执行的步骤的总结
1. 将细胞在1％四氧化锇中后固定
2. 然后通过以增加浓度的乙醇（30％，50％，70％，85％，90％，95％和100％）浸泡10分钟使样品脱水。
3. 接下来，将样品在100％环氧丙烷中漂洗3×10分钟，然后包埋在Spurr树脂中
4. 切割70nm切片并置于铜网上，并用8％乙酸双氧铀在50％乙醇中染色5分钟，并在雷诺氏柠檬酸铅染色中染色5分钟。
5. 现在可以通过TEM分析样品。参照菌株白色念珠菌生物膜的样品照片如下所示（图1）。大多数图片将一次只显示一个或两个单元格，通常横截面，以便您可以看到单元格内部。比例尺表示1μm。
  
  图1.白色念珠菌生物膜细胞的透射电子显微镜图像

食谱

YPD +尿苷

细菌酵母提取物（1％） 10克

细菌蛋白胨（2％）
20克

葡萄糖（2％）
20克

尿嘧啶
0.08克

蒸馏水
1000 ml

将所有成分混合并等分至100 ml瓶中。高压灭菌瓶上的液体循环灭菌。
RPMI + MOPS

RPMI 1640
10.4克

MOPS
34.5克

蒸馏水
700 ml

将所有成分混合在2L烧瓶中。使用10 ml移液管，使用氢氧化钠（5 N）将pH调节至7.0。用蒸馏水将体积升至1升。过滤灭菌RPMI + MOPS到500毫升瓶。在37°C使用，但可以在4°C下存储长达6个月，以防止污染物生长
1x PBS

磷酸二氢钠一水合物（mw = 137.99; 0.038M）
2.62克

磷酸氢二钠
11.5克

氯化钠
43.84克

蒸馏水
500 ml

将上述成分加入到450ml蒸馏水中。如果需要，通过加入1M NaOH将pH调节至7.4。将最终体积加入500ml蒸馏水中。这使10x PBS股票。在蒸馏水中稀释1:10，用于PBS的最终浓度
固定剂
2.5％戊二醛
2.0％多聚甲醛
将上述成分加入0.1M二甲胂酸钠三水合物中。使用此试剂时要小心，因为它很有毒。
雷诺铅柠檬酸盐染色

铅硫酸盐
1.33克

柠檬酸钠
1.76克

蒸馏水
30 ml

1N氢氧化钠
8 ml

将所有成分放在50ml烧瓶中，强力摇动1分钟，然后间歇30分钟，直到完全溶解。然后加入8ml NaOH，并用蒸馏水使体积达到50ml。在使用前过滤灭菌。

参考文献

鲍灵格林州立大学（2012）。雷诺铅柠檬酸盐污渍。检索自www.bgsu.edu/departments/biology/facilities/MnM/TEM/ReynoldsLeadStain.pdf。
Nett，J.E.，Sanchez，H.，Cain，M.T.，Ross，K.M.and Andes，D.R。（2011）。白色念珠菌生物膜基质相关耐药性和细胞壁完整性的界面 Eukaryot Cell 10（12）：1660-1669。
Nett，J.，Lincoln，L.，Marchillo，K.，Massey，R.，Holoyda，K.，Hoff，B.，VanHandel，M.and Andes，D。（2007）。 β-1,3葡聚糖在白色假丝酵母中的推定作用生物膜抗性。 Antimicrob Agents Chemother 51（2）：510-520。
Taff，H.T.，Nett，J.E.，Zarnowski，R.，Ross，K.M.，Sanchez，H.，Cain，M.T.，Hamaker，J.，Mitchell，A.P.and Andes，D.R。（2012）。假丝酵母生物膜诱导的基质葡聚糖传递途径：对药物的影响 PLoS Pathog 8（8）：e1002848。