材料和试剂

350g无特定病原体的雄性Sprague-Dawley大鼠（Harlan）
含有生长的白色念珠菌菌落的平板
环氧乙烷
4路大口径（耐脂质）止回阀（Baxter，目录号：2C62047）
甲苯噻嗪（Sigma-Aldrich，目录号：X1126）
氯胺酮（Sigma-Aldrich，目录号：K2753）
杆菌肽（Sigma-Aldrich，目录号：B0125）
细菌蛋白胨（BD Biosciences，目录号：211677）
细菌酵母提取物（BD Biosciences，目录号：212750）
Betadine（SWIFT，目录号：159935）
Difco琼脂（BD Biosciences，目录号：214530）
Difco葡萄糖（BD Biosciences，目录号：215530）
肝素1000U/ml（Sigma-Aldrich，目录号：H3393）
Intramedic PE 160聚乙烯管（BD Biosciences，目录号：427430）
针座（World Precision Instruments，目录号：14109）
丝编织缝线（尺寸2-0）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-516-130）
大鼠套（Braintress Scientific，目录号：RJ-M）
氯化钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S671-3）
无菌手术巾材料（高压灭菌医院毛巾）
手术按钮连接到线大鼠系绳（Instech Solomon，目录号：LW95S）
尿苷（Sigma-Aldrich，目录号：U3750）
甲苯噻嗪/氯胺酮麻醉剂（见配方）
YPD +尿苷培养基（参见配方）
肝素化盐水（见配方）
0.85％盐水溶液（见配方）
YPD +尿苷板（见配方）

设备

虹膜剪刀（Braintree Scientific，目录号：SC128）
Metzenbaum剪刀（Braintree Scientific，目录号：SC126）
微型剪刀（Braintree Scientific，目录号：SC152）
Hartman蚊子止血钳（世界精密仪器，目录号：15920）
Adson镊子（Braintree Scientific，目录号：FC028）
微组织钳（Braintree Scientific，目录号：FC145，FC146，FC147）
手术刀（Bladex，目录号：22-080-087）
动物保健设施
气体灭菌室
血细胞计数器
以可调温度和速度摇动培养箱
静脉剪刀

程序

将聚乙烯管切成54厘米的段，并使用环氧乙烷进行气体灭菌
麻醉大鼠与大约0.5毫升腹膜内注射1毫克/公斤甲苯噻嗪/氯胺酮混合物。
注意：精确的体积将取决于大鼠的大小。
刮胡子的颈部，中间间隙和前胸部插入导管并用betadine擦洗。
准备一个无菌手术空间包含大鼠在仰卧位。
用540μl肝素（100U/ml）通过双向活栓填充导管片。一旦填充，将活塞放在锁定位置，以确保无菌
创建一个垂直切口正好在前颈部的中线和水平切口在肩胛中区域。从肩胛间区域到垂直切口（安全的皮下按钮末端，在中间肩胛部区域有钉缝，露出大鼠线系绳）将导管皮下地导入。
使用钝的手术解剖，找到并暴露颈静脉，绑住头端
用静脉剪刀在颈内静脉的壁上做一个小的纵向切口
将导管置于切口中，沿着静脉前进，直到右心房上方约2厘米。通过打开活塞并检查导管内流动的血液闪烁来检查是否正确放置
用2-0丝扣将导管固定到静脉。关闭旋塞。
用外科缝合器闭合切口部位。
用杆菌肽处理手术部位，并放上大鼠夹克
使大鼠休息24小时以从导管放置中恢复，并根据标准动物护理方案评估其从手术中恢复。
注意：在整个研究过程中，每8小时检查一次大鼠的健康状况，每天用肝素化盐水冲洗导管。
在大鼠的24小时休息期间，在15ml锥形管中5ml的YPD +尿苷培养物接种在板上生长的白色念珠菌的单个菌落。理想情况下，菌落应该增长到足够容易被挑选（通常需要〜2天），但不是那么老，以至于开始失去其圆形（通常在约10天的生长后）。大多数假丝酵母菌株在YPD +尿苷琼脂平板上生长良好，但可以使用允许研究菌株生长良好的任何培养基。
将接种物在30℃和200rpm下温育过夜
过夜培养物的细胞浓度通过血细胞计数器上的细胞计数来确定
将接种物在0.85％盐水中稀释至1×10 6个细胞/ml 通过将未使用的接种物接种在YPD +尿苷平板上来证实存活细胞计数
将540μl稀释的接种物加入到导管的腔内部分（通过旋塞阀），并使其粘附6小时。
然后在打开位置通过活栓取出接种物，并用100U/ml肝素化盐水填充导管体积。然后关闭旋塞阀。
然后允许导管中的微生物生长48小时注意：如果需要，可以在24小时的生长后将药物给予导管管腔（通过旋塞阀），以测试生物膜的体内药物敏感性。
在生长期结束时，根据动物安全方案处死大鼠。使用所有无菌工具和用品在无菌手术环境中从大鼠中取出导管，并切割成大约1-2cm长的段。
在这一点上，协议基于正在进行的实验实验的性质而发散

食谱

甲苯噻嗪/氯胺酮麻醉剂
以1:3体积/体积比混合20mg/ml甲苯噻嗪和50mg/ml氯胺酮
YPD +尿苷培养基

细菌酵母提取物（1％） 10克

细菌蛋白胨（2％）
20克

葡萄糖（2％）
20克

尿嘧啶
0.08克

蒸馏水
1000 ml

将所有成分混合并等分至100 ml瓶中。高压灭菌瓶上的液体循环灭菌。
肝素化盐水
在0.85％盐水溶液中稀释肝素至100U/ml
0.85％盐水溶液

氯化钠
4.25克

蒸馏水
500 ml

液体循环高压灭菌。

YPD +尿苷板

细菌酵母提取物（1％）	10克
细菌蛋白胨（2％）	20克
葡萄糖（2％）	20克
细菌琼脂（2％）	20克
尿嘧啶	0.08克
蒸馏水	1000 ml

将所有成分在2L烧瓶中混合，高压灭菌器在液体循环中灭菌，然后倒入板中

参考文献

Andes，D.，Nett，J.，Oschel，P.，Albrecht，R.，Marchillo，K.and Pitula，A。（2004）。体内中心静脉导管的发育和表征假丝酵母白蛋白生物膜模型。 Infect Immun 72（10）：6023-6031。
Taff，HT，Nett，JE，Zarnowski，R.，Ross，KM，Sanchez，H.，Cain，MT，Hamaker，J.，Mitchell，AP and Andes，DR（2012）。假丝酵母生物膜诱导的基质葡聚糖递送途径：对药物抗性的影响。 PLoS Pathog 8（8）：e1002848。