（Augustin等人，2012）。所有四种酶都利用尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose）。来自Barbarea vulgaris的UGT73C10-UGT73C13催化的葡糖基化反应（UDP-glc）作为葡糖基部分供体底物和不同的皂苷元，例如齐墩果烷皂甙元齐墩果醇酸和常春藤苷配基作为葡糖基部分受体底物。

材料和试剂

尿苷-5'-二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）（例如Sigma-Aldrich，目录号：S451649）
尿苷-5'-二磷酸 - [14 C]葡萄糖（UDP- [14 C] Glc）（例如，PerkinElmer，目录号：NEC403050UC ）
N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸（TAPS）（例如Sigma-Aldrich，目录号：T5130）
牛血清白蛋白（BSA）（例如Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
二硫苏糖醇（DTT）（例如Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
硅胶60F 254 板（例如 EMD Millipore，目录号：1055540001）
适当的E。大肠杆菌蛋白质表达菌株（例如菌株XJb（DE））（Zymo Research，目录号：T5051）
FRETWorks S标签测定试剂盒（EMD Millipore，目录号：70724）
TAPS缓冲区
1.6 mM齐墩果酸储备溶液（见配方）
1.6 mM常春配基原液（见配方）
用于36UGT73C11酶测定反应的预制备混合物（参见配方）
用于37 UGT73C13酶测定反应的预主混合物（参见Recipes）

设备

真空离心机（例如Labogene，目录号：7.008.100.777）
TLC显影室（例如，VWR international，目录号：21432-739）
储存荧光屏（如 GE healthcare，目录号：28-9564-74）
磷光体（例如 Molecular Dynamics，型号：STORM 840）

软件

ImageQuant 5.0（Molecular Dynamics）或类似的
SigmaPlot 11.0（Systat Software，Inc.）或类似的

程序

I. 放射性标记的皂苷元 - 葡萄糖苷标准品和具有参考稀释系列的TLC板的制备

将100μl（6.623nmol [74kBq]）UDP- [14 C] Glc蒸发至干在1.5ml微量离心管中使用真空离心机。的使用相同的微量离心管制备200μl的a 葡萄糖化反应主混合物用于产生参考葡萄糖苷。
最终反应条件葡糖基化反应调节至25mM TAPS pH 8.6,1mM DTT， 33.12μMUDP- [14 C] Glc（通过溶解干燥的6.623nmol）和467μM 非放射性UDP-Glc（另外加入）。
冷冻（-80℃）。将重悬浮于10mM TAPS缓冲液pH 8.0中的大肠杆菌细胞通过解冻裂解（参见注释），并通过离心除去不溶性细胞碎片在20000xg，4℃下20分钟。
浓度的重组UGT。大肠杆菌裂解物 FRETWorks S标签测定试剂盒根据制造商的说明。
E。将含有重组UGT73C11的大肠杆菌裂解物加入到原模中混合至终浓度200ng /μlUGT73C11。 60微升的这个主人混合物转移到0.5ml微量离心管中。
通过加入4μl的1.6mM糖苷配基开始酶促反应储备溶液。在我们的情况下，应用的苷元是皂苷元齐墩果酸和常春配基，其已溶解于100％DMSO中（因此，酶的糖苷配基和DMSO的最终浓度反应分别为100μM和6.25％）
完成转换的所提供的苷元与其相应的葡糖苷通过在37℃下孵育反应过夜（18小时）（不振荡此步骤必需）。
通过TLC评价转化效率分析。为此目的，皂草苷 - 葡糖苷和可能剩余的皂甙元用50μl乙酸乙酯萃取4次从完全反应的20μl等分试样。
合并的乙酸乙酯级分在真空离心机中蒸发至干。
将干燥的提取物溶于20μl96％乙醇中溶液逐步（3.5μl/步）点样到硅胶TLC板上。使用甲醇作为流动相将TLC板预运行1-2分钟直到溶剂前沿高于装载线约1cm。
将甲醇在通风橱和干燥板中蒸发随后用二氯甲烷：甲醇：水（80:19:1）展开流动相。蒸发后的流动相为展开板用10％硫酸的甲醇溶液喷雾并加热至100℃ 直到皂苷元和皂苷元 - 葡糖苷变为可见的带红色带在TLC板上。
在可见光以及长波UV（366nm）光下评价染色的TLC板
为了产生14 C标记的皂苷元 - 葡萄糖苷的标准曲线，进行葡糖苷化反应的连续稀释。
的最高选择的皂苷元 - 葡萄糖苷浓度为标准曲线是与62.5％乙醇的过夜反应的1:5稀释，对应于20μM的皂苷元 - 葡萄糖苷浓度。
这个稀释液用50％乙醇依次稀释11倍用皂草苷 - 葡萄糖苷浓度为10μM生成稀释液 μM，2.5μM，1.25μM，0.625μM，0.313μM，0.156μM，0.078μM，0.039μM， 0.020μM和0.010μM。
每个稀释液20μl为5μl步骤加载到硅胶TLC板上，相当于每个斑点的皂苷配基 - 葡糖苷量为400nmol，200nmol，100nmol，50 nmol，25nmol，12.5nmol，6.25nmol，3.13nmol，1.56nmol，0.78nmol，分别为0.39nmol和0.20nmol。
蒸发后全部溶剂，将TLC板预先运行1-2分钟，使用甲醇作为流动相直到溶剂前沿约1cm以上装载线。
将甲醇在通风橱中蒸发，并随后用TLC板显影二氯甲烷：甲醇：水（80:19:1）作为流动相。
所有使溶剂蒸发，并加入1.5μl，1.0μl和0.5μl 原始主混合物的葡糖基化反应（加入前）皂苷元）点在TLC板的未使用的侧泳道上。这些斑点将允许在稍后的点的变化的归一化不同反应主混合物之间的放射性注意：
1. 当地法规可能要求您在专门领域使用放射性化合物。请告知自己有关在工作场所使用的放射性化合物的使用规定和准则。
2. 因为Perkin Elmer提供了溶解在70％乙醇中的这种试剂，所以在使用前将Glc干燥，其用作所研究的UGT本身的糖受体底物。
3. 在这种情况下，重组UGT在BL21（DE）衍生物XJb（DE）中表达。该菌株表达病毒内溶素蛋白，因此允许通过在冷冻后简单解冻而溶解。
4. 使用FRETWorks S标签测定试剂盒的定量基于RNaseS活性的再生，因为S蛋白（包含在试剂盒中）和N末端融合到重组表达的UGT的S标签的相互作用。有关其他信息，请参阅工具包手册。
5. 作为未修饰的皂苷元的参考文献，是用于测定转化效率的2nmol齐墩果酸和常春配基加载到TLC板上。
6. 在长波UV光下硫酸染色的TLC板上的皂苷配基/皂苷 - 葡萄糖苷评价比在可见光下的灵敏度大约高10倍。
图2.具有产生可放射性的（1）3-O- [14 C] glc-齐墩果酸（oa-glc）或（3）3-O- [ 14 C] glc-hederagenin（he-glc）标准品。在（A）可见（有色）以及（B）长波紫外光（366nm，黑/白）下评价TLC板。为了比较目的，将加载到泳道（2）的真正（oa）齐墩果酸和（he）常春配基（每种2nmol）。

II。制备用于测定酶动力学参数的酶测定法

在UGT73C11酶的制备中，使用真空离心机在1.5ml微量离心管中将228μlUDP- [14 C] Glc（15.10nmol [168.72kBq]）蒸发至干。
在另外两个1.5ml微量离心管中将2.39μl和2.18μl的1mM UDP-Glc（非放射性）溶液蒸发至干。同时，对于UGT73C13测定，将86.4μlUDP- [14 C] Glc（5.72nmol [63.94kBq]），1.99μl0.5mM UDP-Glc（非放射性）和1.59μl0.25mM UDP -Glc（非放射性）在1.5ml微量离心管中干燥。
受体底物，齐墩果酸和常春配基，用于在100％DMSO中制备浓度为128μM，96μM，64μM，32μM，16μM，8μM，4μM和2μM的UGT73C11测定储备溶液。
对于UGT73C13测定，制备了1,600μM，1,200μM，800μM，400μM，200μM，100μM，50μM和25μM的受体底物储备溶液。
冷冻（-80℃）E的等分试样。通过解冻（参见注释）裂解重悬浮于10mM TAPS缓冲液pH 8.0中的大肠杆菌细胞，并通过在20,000xg，4℃下离心20分钟除去不溶性细胞碎片。
重组UGT在E中的浓度。通过应用FRETWorks S标签测定试剂盒根据制造商的说明书测定大肠杆菌裂解物。
E。用在10mM TAPS缓冲液pH 8.0中的10mg/ml BSA将大肠杆菌裂解物稀释至5ng /μl（UGT73C11）或50ng /μl（UGT73C13）重组蛋白。

III。 UGT73C11的酶测定

制备用于36种酶测定反应的预先混合物，如配方部分所述
将427.4μl该预先混合物加入到含有干燥的UDP- [14 C] Glc的微量离心管中以制备反应主混合物，其将导致糖供体底物的浓度为33.12 μMUDP- [14 C] Glc（0.37kBq /μl）和467μM非放射性UDP-Glc。
将96μl该主混合物转移到其中已干燥2.39μl1mM UDP-Glc并与144μl原始预制备混合物混合的试管中。用该主混合物建立的酶测定将具有13.25μMUDP- [14 C] Glc（0.15kBq /μl）和487μM非放射性UDP-Glc的糖供体底物浓度。
将82μl后面的主混合物转移到其中2.18μl1mM UDP-Glc已经干燥的管中，并与82μl的原始预先混合物混合。该最后的主混合物用于制备浓度为6.62μMUDP- [14 C] Glc（0.08kBq /μl）和493μM非放射性UDP-Glc的酶测定。
将18.75μl等份的主混合物转移到冰上的1.5ml微量离心管中。
为了进行实际测定，将具有主混合物等分试样的管在30℃下预温育3分钟，并通过加入在步骤B-3中制备的1.25μl受体底物储备溶液开始酶反应。
1. 使用具有最高浓度的UDP- [14 C] Glc（33.12μM）的主混合物来测定具有1μM，0.5μM，0.25μM和0.125μM的最终糖受体底物浓度的UGT73C11，通过加入1.25μl的16μM，8μM，4μM和2μM齐墩果酸或常春配基储备溶液。
2. 类似地，用于4和2μM齐墩果酸和常春配基的最终浓度的13.25μMUDP- [14 C] Glc主混合物和6.62μMUDP- [14 C] C] Glc主混合物，最终浓度为8和6μM的两种受体底物。在这些情况下，相应的储备溶液为64μM，32μM，128μM和96μM。
在加入受体底物后，通过在30℃温育3分钟使酶促反应发生，随后通过加入50μl乙酸乙酯并剧烈混合10秒停止。

IV。
UGT73C13的酶测定（通常类似于程序C，但是酶和底物浓度不同，因为UGT73C13在催化所研究的反应中效率较低）

制备用于37种酶测定反应的预主混合物，如配方部分所述
将405μl预 - 主混合物转移到具有干燥的UDP- [14 C] Glc的管中，以制备用于酶测定的反应主混合物，终浓度为13.25μMUDP- [ 14 C] Glc（0.15kBq /μl）和487μM非放射性UDP-Glc。
将150μl该主混合物与150μl预 - 主混合物在已经干燥了1.99μl0.5mM UDP-Glc的微量离心管中混合。将该主混合物用于具有6.62μMUDP- [14 C] Glc（0.08kBq /μl）和493μM非放射性UDP-Glc的最终糖供体底物浓度的反应。
对于具有3.31μM（0.04kBq /μl）和497μM非放射性UDP-Glc的最终UDP- [14 C] Glc浓度的酶测定的主混合物，120μl之前的主混合物用含有干燥的1.59μl0.25mM UDP-Glc的试管中的120μl预 - 主混合物稀释。应用13.25μMUDP- [14 C] Glc预混合物用于最终齐墩果酸和常春藤苷酸浓度为1.56μM，3.12μM和6.25μM的测定。
将1.25μl的25μM，50μM和100μM糖受体底物储备溶液加入到18.75μl主混合物中以调节这些糖受体底物浓度。类似地，用于测定12.5μM和25μM（200μM和400μM储备溶液）的最终糖受体底物浓度的6.62μMUDP- [14 C] Glc主混合物和3.31μM用于糖受体底物浓度为50μM，75μM和100μM（800μM，1,200μM和1,600μM储备溶液）的UDP- [^{14 C] Glc主混合物。}

V. 酶测定的分析

终止的测定用50μl乙酸乙酯萃取4次，合并的乙酸乙酯萃取物在真空离心机中蒸发至干。
将干燥的提取物溶于20μl96％乙醇中，并以5μl步骤加载到硅胶TLC板上。
将潜在的剩余的放射性皂苷元 - 葡萄糖苷用另外20μl96％乙醇洗出并加载到TLC板上的相同点。
使用甲醇作为流动相将TLC板预运行1-2分钟，直到溶剂前沿在装载线上方约1cm。
将甲醇在通风橱中蒸发，干燥的TLC板随后用二氯甲烷：甲醇：水（80:19:1）作为流动相显色。
蒸发流动相后，将0.5μl，1.0μl和1.5μl具有最高UDP- [14 C] Glc的主混合物点在TLC板的未使用的泳道上。另外，还有1μl的两个剩余的主混合物，其中较低的UDP- [14 C] Glc点样到每个TLC板。
将干燥的TLC板与相同皂苷元 - 葡萄糖苷的制备的参比稀释系列TLC板之一一起暴露于储存磷光体屏幕数天。
用STORM 840磷光成像仪扫描曝光的荧光屏，使用ImageQuant 5.0对数字扫描中的信号强度进行定量。
为了补偿与用于产生参考葡萄糖苷的主混合物相比较低10倍的放射性糖供体底物浓度，所有浓度都是由3.31μMUDP- [在将其进一步评估之前乘以10倍。类似地，由13.25μM和6.62μMUDP- [14 C] Glc主混合物产生的皂苷元 - 葡萄糖苷强度乘以2.5和5。
为了进一步解决用于产生参考葡萄糖苷的主混合物中UDP- [14 C] Glc的量的无意的变化和实际的酶测定，将测定的所有葡萄糖苷强度乘以比率在每个TLC板上的相应主混合物斑点的强度之间。
K sub和V sub max，使用SigmaPlot 11.0计算值，根据Michaelis-Menten方程式或底物抑制的速度方程式进行非线性回归（有关如何执行回归的指令，请参阅SigmaPlot手册）。
注意：
1. 在这种情况下，重组UGT在BL21（DE）衍生物XJb（DE）中表达。该菌株表达病毒内溶素蛋白，因此允许通过在冷冻后简单解冻而溶解。
2. 大肠杆菌细胞所有裂解物，裂解物稀释液和主混合物都保持在冰上。
3. 使用FRETWorks S标签测定试剂盒的定量基于RNaseS活性的再生，因为S蛋白（包含在试剂盒中）和N末端融合到重组表达的UGT的S标签的相互作用。有关其他信息，请参阅工具包手册。
4. 大肠杆菌裂解物用BSA溶液代替纯的缓冲液稀释，因为重组UGT的比活性在总蛋白浓度降低时可以看出降低。
5. 所研究的酶的最终量应根据其活性来选择。如果在所应用的孵育时间内用尽过多的受体底物，则确定的反应速度将不再处于初始线性范围内。
6. 使用具有不同比例的放射性标记的未标记的UDP-Glc的主混合物的意图是使用少量的放射性标记的UDP- [ ^{14 sup> C] Glc，同时仍然确保用于具有最低受体底物浓度的测定的足够的信号强度。在整个实验期间保持500μMUDP-Glc的最终总浓度，以提供糖供体底物的饱和条件。}
7. 选择UGT73C11和UGT73C13的测定中的不同pH是由于两种酶的最佳pH不同。
8. 测试受体底物的哪些浓度，取决于所研究的酶。为了确定最佳浓度，有助于在预实验中估计Km值，并选择低于和高于估计的K m 最后的实验。
9. 最佳反应时间取决于酶活性和酶量。必须进行时程实验以确定在选择的温育时间之后反应速度是否仍然在初始线性范围内。如果太多的受体底物在最低应用浓度下转化，则所得到的v/S特性通常是S形的而不是双曲线的。
图3.TLC板的放射自显影图，以确定UGT73C11对常春配基的动力学参数具有来自实际酶测定的乙酸乙酯提取物的TLC板在顶部以及底部，而共同暴露的TLC具有[14 C] Glc-常春配基标准曲线的平板位于中间。表示3-O- [14 C] Glc-常春藤苷酸的带是每个用箭头标记的平板和标记物his-glc。低于UGT73C11酶测定提取物的he-glc条带的浓度表示相应酶测定中的常春配基浓度，而I和II标记重复。每个标准曲线下面的物质量表示存在于相应泳道中的[14 C] Glc-常春藤苷酸的量。将主混合物等分试样以说明主混合制备物（MM1，MM2，MM3）中UDP- [14 C] Glc的量的变化，利用实际测定在泳道的右边或左边点样，或者标准

食谱

1.6mM齐墩果酸储备液
将7.30mg齐墩果酸溶于10ml DMSO中
1.6mM常春配基原液
将7.56mg常春配基在10ml DMSO中溶解
用于36UGT73C11酶测定反应的预制混合物
36微升500mM TAPS缓冲液，pH8.6 3.6μl200mM DTT
36μl9.34 mM UDP-Glc
72μl10mg/ml BSA
72μl5ng /μlUGT73C11（稀释的大肠杆菌裂解物）
455.4μl水
用于37 UGT73C13酶测定反应的前主混合物
37μl500mM TAPS缓冲液pH7.7 37μl200 mM DTT
37μl9.34mM UDP-Glc<
74μl10mg/ml BSA
74μl50ng /μlUGT73C13（稀释的大肠杆菌裂解物）
465.05μl水

致谢

该协议适应和修改从各种，以前基于14C-UDP葡萄糖的UGT酶分析协议，通常应用于植物生物化学部门 - 植物生物化学生物系 - 生命科学系 - 哥本哈根大学和前面的组织。这项工作得到了丹麦独立研究，技术和生产科学委员会（授予号09-065899/FTP和274-06-0370）的支持，由Villum Kann Rasmussen基金会授予Pro-Active植物，并通过博士哥本哈根大学生命科学学院（至JMA）的津贴。

参考文献

Augustin，JM，Drok，S.，Shinoda，T.，Sanmiya，K.，Nielsen，JK，Khakimov，B.，Olsen，CE，Hansen，EH，Kuzina，V.，Ekstrom，CT，Hauser， Bak，S。（2012）。来自寻常型巴布达UGT73C亚家族的UDP-糖基转移酶催化皂苷元3- O-葡糖基化在皂苷介导的昆虫抗性中。植物生理学 160（4）：1881-1895。