图1.来自巴巴多巴的UGT73C10-UGT73C13催化的葡萄糖基化反应（Augustin等人，2012）。所有四种酶利用尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glc）作为葡萄糖基部分供体和不同的皂苷元，例如齐墩果烷醇皂甙元齐墩果酸和常春藤苷元作为葡糖基部分接受体。齐墩果酸和常春藤苷酸都天然存在于G型B中。 vulgaris，其中它们主要以其3-碳/β-半乳糖基化形式存在。来自G型的附加皂苷B. vulgaris 已经由Nielsen等人2010鉴定。然而，发生在B中的大多数皂苷和皂苷元。 vulgaris 仍然不明。

材料和试剂

牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）（Sigma-Aldrich，目录号：77627）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
乙酸乙酯（Sigmal-Aldrich，目录号：34972）
N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸（TAPS）（Sigma-Aldrich，目录号：T5130）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
尿苷-5'-二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）（Sigma-Aldrich，目录号：S451649）
硅胶60F 254 TLC板（EMD Millipore，目录号：1055540001）
聚偏二氟乙烯（PVDF）滤板（孔径0.45μm）（EMD Millipore，目录号：MAHVN4510）
FRETWorks S标签测定试剂盒（EMD Millipore，目录号：70724）

设备

水浴
离心机用于50ml和15ml锥形离心管（VWR international，目录号：89004-368）
Thermomixer（VWR international，目录号：21516-168）
pH指示剂纸（Whatman，目录号：2600-100A）
真空离心机（Labogene，目录号：7.008.100.777）
薄层色谱（TLC）显影室（VWR international，目录号：21432-739）
Aldrich烧瓶型喷雾器（Sigma-Aldrich，目录号：Z190373）
热块（VWR international，目录号：12621-120）
在配备有Gemini NX柱（Phenomenex）的Agilent 1100系列LC（Agilent Technologies）上进行LC-MS分析，并与Bruker HCT-Ultra离子阱质谱仪（Bruker Daltonics）偶联，

软件

DataAnalysis 4.0（Bruker Daltonics）

程序

I. 制备粗代谢物提取物

称重新鲜收获的野螟叶，并转移到15ml离心管中。
在每克新鲜叶材料加入5ml 55％乙醇后，将叶子在水浴中煮沸10分钟。
为了提高提取效率，偶尔在沸腾时摇动管。
加热后，将提取物在冰上冷却，然后将其离心5分钟（3,000xg，室温），以沉淀不溶性叶碎片。
将上清液转移至新鲜离心管中并在-20℃下储存直至进一步使用。建议在-20°C下最少孵育时间为4小时，以使更多的不需要的化合物从溶液中沉淀。
通过离心（3,000×g，5分钟，4℃）除去新出现的沉淀物。
注意：
3. 在预实验中已经确定55％的乙醇是足够疏水以仍然提取普通皂甙，同时亲水性足以降低之前见到的干扰TLC分析的一些疏水化合物的量。然而，应该注意，这些提取物仍然含有比仅仅皂苷更多的化合物。

II。酸性水解和纯化：

将2×1.25ml粗皂甙提取物转移到2ml微量离心管中，并与250μl6M HCl混合，将最终HCl浓度调节至1M。
将酸化的提取物在调节至99℃的温度并以1,400rpm振摇的热混合器中温育24小时。
加热后，将提取物在-20℃下冷冻约1小时，然后将其在50ml离心管中合并。
通过用250μl96％乙醇洗涤每个管3次回收在两个微量离心管中的剩余沉淀。将这三个洗涤步骤的所得乙醇溶液加入50ml离心管中的水解产物中。
将1M Tris碱溶液加入到水解产物中直至pH从酸性变为碱性条件（这里为4.5ml）。
随后，加入13.55ml水以将乙醇浓度降低至14％。将1.125g PVPP和225mg BSA加入到溶液中，以将它们的最终浓度分别调节至5％（w/v）和10mg m -1 s -1。
将混合物用乙酸乙酯萃取6次，每次萃取使用5ml乙酸乙酯。
通过在5,200×g离心20分钟实现相分离。乙酸乙酯部分为上层相
将合并的乙酸乙酯级分在真空离心机中蒸发至干。
将干燥的提取物溶于500μl96％乙醇中，并转移至15ml离心管中。对于第二轮纯化，以给定的顺序加入3,720μl水，480μl500mM TAPS pH 9.1,240mg PVPP和48mg BSA，并且每次提取步骤用2ml乙酸乙酯进行5倍乙酸乙酯萃取。
在真空离心机中蒸发合并的乙酸乙酯级分的溶剂后，将干燥的提取物溶于1ml 96％乙醇中。注意：
1. 在洗涤步骤期间，发现在台式微量离心机中短暂旋转足以从水解产物中回收沉淀。
2. 由于缺乏调查，如果皂草苷元在所选择的水解条件下保持溶解或者在观察到的沉淀物中，则将两种组分进行后续的纯化步骤。
3. 通过在萃取前加入Tris碱将水解产物的pH转变为碱性条件，因为乙酸乙酯萃取带有低量的水/离子，这导致初始水解产物萃取物具有微酸性pH。我们研究的UGT具有略微碱性的pH最佳值，并且弱碱性缓冲的皂苷元提取物被认为对最终酶测定的pH具有较低的影响。
4. 通过在pH指示剂纸上点样1μl水解产物来监测pH变化。
5. 必须在乙酸乙酯之前降低水解产物的乙醇浓度，萃取以在加入乙酸乙酯时形成有机相。
6. 在没有PVPP/BSA纯化步骤的情况下产生的水解的粗制巴巴巴树叶提取物的早期乙酸乙酯提取物被认为完全抑制所研究的UGT的活性。 PVPP用于吸附酚类化合物。在纯化步骤中加入BSA，因为在使用早期水解提取物的酶测定中，观察到蛋白质通过与来自提取物的化合物结合而变为褐色。加入BSA是为了除去这种蛋白质结合化合物。
7. 在真空离心机中干燥乙酸乙酯级分的同时，出现新的水相，在该过程中将其除去。

III。重糖基化测定：

在再葡糖基化测定的制备中，将500μl水解和纯化的B。寻常的叶代谢物提取物在真空离心机中干燥，随后溶于78.13μl二甲基亚砜（DMSO）中。
此外，重组表达的UGT在E内直接定量。应用FRETWorks S-tag测定试剂盒的大肠杆菌裂解物。
定量后，通过稀释E将UGT浓度调节至50ng /μl。大肠杆菌裂解物与在10mM TAPS pH 8.0中的10mg/ml BSA反应。
酶活性测定在1.5ml微量离心管中进行，终体积为50μl。
将反应条件调节至25mM TAPS pH 8.6（UGT73C9-C11），pH7.9（UGT73C12/C13）或pH8.2（UGT73C9，UGT73C10或UGT73C11与UGT73C12或UGT73C13的组合），1mM DTT和1mM UDP-Glc。每次反应的最终UGT量为750ng。
反应在30℃下预温育3分钟，并通过加入3.13μl水解和纯化的B开始。寻常的叶代谢物提取物在DMSO中。
将测定在30℃下孵育30分钟（仅LC-MS）或120分钟（TLC和LC-MS），并通过加入325μl冰冷甲醇（LC-MS）或50μl冰冷的乙酸乙酯TLC）注意：
1. 在再葡糖基化测定之前，将水解的提取物的溶剂从乙醇交换为DMSO，因为发现乙醇作为所应用的UGT本身的底物。
2. 使用FRETWorks S标签测定试剂盒的定量是基于RNA酶S活性的再生，因为S蛋白（包含在试剂盒中）的相互作用和N末端融合的S标签重组表达的UGTs。
3. 用BSA溶液代替纯缓冲液稀释大肠杆菌裂解物，因为看到重组UGT在减少后丧失比活性。总计蛋白质浓度。
4. 每当测试不同UGT的组合时，以等摩尔量施用各个酶。

IV。通过薄层色谱法（TLC）

停止的酶反应用乙酸乙酯（50μl，185μl和50μl）萃取三次：
1. 向酶反应和样品中加入乙酸乙酯用涡旋振荡器充分混合约10-20秒。（The 加入乙酸乙酯停止反应的同时也使用对于第一提取步骤。）
2. 将样品离心 5分钟（16,100×g，室温），以实现相分离。乙酸乙酯级分将是上相。
将合并的乙酸乙酯级分在真空离心机中蒸发至干，将干燥的提取物溶于20μl96％乙醇中
将再溶解的提取物逐步完全（每步3.5μl）加载到硅胶TLC板上。
TLC板在100％甲醇中预运行，直到溶剂前沿在装载线上方约1cm。
将甲醇在通风橱中蒸发，随后使用二氯甲烷：甲醇：水（80:19:1）作为流动相显影TLC板。
通过使用烧瓶型喷雾器（或类似物）在TLC板上喷洒10％硫酸的甲醇溶液，随后在加热块（图2）上加热至100℃，使皂苷配基和皂苷元 - 葡糖苷显色。注意：所需的显影液量取决于所使用的TLC板的尺寸。板应该一致且均匀地润湿。但是，喷洒过多的显影液可能会导致色带扩散。

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图2.具有（1）G型B的TLC板。（2）相应的酸性水解代谢物提取物和（3） - （7）水解的代谢物提取物与不同的B接触。 vulgaris UGTs。在（A）可见（有色）以及（B）长波UV（366nm，黑/白）下评价TLC板。应用的用于葡萄糖基化测定的UGT是（3）UGT73C9，（4）UGT73C10，（5）UGT73C11，（6）UGT73C12，（7）UGT73C13。为了比较的目的，使用了真正的（oa）齐墩果酸，（he）常春配基，（oa-glc）3-氨基-glc齐墩果酸，（he-glc）3-em （参考）参考泳道（每个2nmol）上的β-glc-常春配基。另外是（oa细胞）齐墩果酸纤维二糖苷和（he-细胞）常春配基纤维二糖苷，天然存在于G型胚中。寻找这两种皂苷元的二糖苷形式，在粗代谢物提取物中标记。因此，（agly）糖苷配基，（m-glc）单葡萄糖苷和（二葡萄糖）二糖苷的迁移率显示在图2B的右侧。

V. 通过液相色谱 - 质谱（LC-MS）

将停止的酶反应离心5分钟（16,100×g，室温）以沉淀蛋白质。
将上清液转移到新鲜的1.5ml微量离心管中，并在真空离心机中蒸发至干。
将干燥的提取物溶于30μl甲醇中，随后通过加入30μl水将溶剂稀释至50％甲醇的最终浓度。
过滤甲醇提取物（PVDF，0.45μm孔径），并转移到1.5ml玻璃样品瓶中用于LC-MS分析。
在配备有Gemini NX柱（35℃）（2.0×150mm，3.5μm）的Agilent 1100系列LC上进行LC-MS分析，并与Bruker HCT-Ultra离子阱质谱联用。
LC中的流动相是含有0.1％（v/v）甲酸（洗脱液A）和含有0.1％（v/v）甲酸的乙腈的水（洗脱液B）。梯度程序如下：0至1分钟，等度12％B; 1〜33分钟，线性梯度12〜80％B; 33至35分钟，线性梯度80至99％B; 35至38分钟等度99％B; 38至45分钟等度12％B，以0.2ml min <-1> 的恒定流速。
MS检测器以负电喷雾模式操作，并且MS ^{2（= MS/MS）和MS （= MS/MS的MS/MS） >碎片）碎裂以获得检测离子的另外的结构信息。}
运行文件用DataAnalysis 4.0分析，该软件显示LC色谱图和相应的MS谱图。请参见Augustin等人（2012）（和在线补充数据）以查看来自G-和P型B的粗代谢物提取物的LC色谱图。来自两种植物的酸性水解代谢物提取物以及用不同B的相应的葡萄糖基化测定的色谱图。 vulgaris UGT。

参考文献

Augustin，JM，Drok，S.，Shinoda，T.，Sanmiya，K.，Nielsen，JK，Khakimov，B.，Olsen，CE，Hansen，EH，Kuzina，V.，Ekstrom，CT，Hauser， Bak，S。（2012）。来自寻常型巴布达UGT73C亚家族的UDP-糖基转移酶催化皂苷元3- O-葡糖基化在皂苷介导的昆虫抗性中。植物生理学 160（4）：1881-1895。
Nielsen，N.J.，Nielsen，J。和Staerk，D。（2010）。来自抗虫十字花科植物的抗性相关皂苷 Barbarea vulgaris 。 J Agric Food Chem 58（9）：5509-5514。