材料和试剂

PerCP/Cy5.5抗小鼠CD11b（Biolegend，目录号：101228）
PE/Cy7抗小鼠CD11c（BD Bioscience，目录号：558079）
APC/Cy7抗小鼠CD19（BD Bioscience，目录号：557655）
APC抗小鼠CD3e（Biolegend，目录号：100312）
FITC抗小鼠TNFα（Caltag，目录号：RM9011）
PE抗小鼠IL-12（BD Bioscience，目录号：554479）
aCD16/32FcBlock（BD Bioscience，目录号：553142）
FITC抗小鼠CD8（BD Bioscience，目录号：553031）
PE抗小鼠CD8（BD Bioscience，目录号：553033）
PerCP/Cy5.5抗小鼠CD4（Biolegend，目录号：100539）
PE/Cy7抗小鼠CD8（Biolegend，目录号：100722）
APC抗小鼠CD8（BD Bioscience，目录号：553035）
Ultrapure O111：B4 EC LPS（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：tlrl-pelps）}
合成脂质IVa（Peptides International，目录号：CLP-24006-S）
ODN1826（Coley Pharmaceuticals）
磨砂玻璃片，非无菌（Fisherbrand，目录号：12-550-343）
Cytofix/Cytoperm溶液（BD Biosciences，目录号：554722）
10×Perm洗涤缓冲液（BD Biosciences，目录号：554723）
10％多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：15712-S）
RPMI 1640培养基（含glutamax，HEPES，酚红）（Life Technologies，目录号：72400-120）
胎牛血清（FBS）（热灭活）（Hyclone，目录号：SH30070.03HI）
Pen/Strep（Life Technologies，目录号：15140-122）
β-ME（Sigma-Aldrich，目录号：M-7522）
NaCl
KCl
KH ₂ PO ₄
Na HPO ₄
NaOH
NH 4 Cl
NaHCO 3
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
1x PBSA /叠氮化物（PBSA/az）（请参阅配方）
RBC裂解缓冲液（参见配方）
培养基（见配方）
布雷菲德菌素A（Sigma-Aldrich，目录号：B6542）（参见Recipes）

设备

15ml锥形管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352196）
50ml锥形管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352070）
FACS钛管微管（Bio-Rad Laboratories，目录号：223-9391）
70μM滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352350）
组织培养（TC）皿（100×20mm）（Corning Incorporated，目录号：430167）
96孔圆底板（Corning Incorporated，目录号：3799）
BD FACS Canto I（6色分析仪）流式细胞仪：配备2个激光器; 蓝色激光488 nm四色检测和红色激光633 nm 2颜色检测。使用FACSDiva软件
离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R）

软件

FACSDiva软件
BD FACS Canto I软件

程序

脾细胞分离
1. 从小鼠提取整个脾脏，放在15毫升聚丙烯管在冰上（没有液体）
2. 将5 ml RBC裂解缓冲液加入15ml含有脾的管中
3. 将脾脏用RBC裂解缓冲液倒入10cm组织培养皿中
4. 通过将脾脏放置在载玻片的磨砂部分的粗糙侧上（用RBC裂解缓冲液润湿），在磨砂玻璃载玻片之间彻底地脾脏磨碎，并在两个载玻片之间研磨直到脾（视频1）。
  
  视频1.两个玻璃片之间的脾匀浆
5. 吸取含有脾细胞的RBC裂解液回到15ml管中
6. 向管中加入10ml培养基，倒转2-3次
7. 在4℃下以1,300rpm旋转5分钟
8. 弃去上清液并将沉淀重悬在3ml培养基中。
9. 通过50μm锥形管过滤通过70μM过滤器
10. 计数1：100稀释的细胞
11. 在RPMI培养基中稀释单细胞悬浮液至1×10 7个细胞/ml（对于流动分析，不需要计数和计算细胞）。
12. 将脾细胞置于冰上，直到准备平板到96孔板。
刺激脾细胞
1. 准备加入Brefeldin A的RPMI培养基的储备液，浓度为10μg/ml
2. 涡旋和旋转所有LPS股票，然后每个声波10分钟。超声后，再次涡旋和旋转
3. 使用含布雷菲德菌素A的培养基将每种刺激（EC LPS，PA，YP，脂质IVa）制备成其所需最终浓度的两倍（2x）。
4. 将100μl的每种刺激平板接种到96孔板的合适孔中，包括未刺激的孔作为对照
5. 板100微升的脾细胞进入适当的孔（板额外的脾细胞作为单一的污点控制）。
6. 将板在37℃下孵育4小时。
免疫细胞化学（ICC）染色
1. 4小时后，用20μl20mM EDTA处理孔
2. 混合并在37℃孵育10分钟
3. 孵育后再次混合，然后以1,300rpm旋转5分钟
4. 吸出或闪烁介质。
5. 用100μl稀释的FcBlock（PBSA/az中的1:100FcBlock）封闭到所有孔中
6. 在冰上孵育15分钟。
7. 加入100μlPBSA/az，然后以1,300rpm旋转5分钟
8. 吸出或闪烁介质。
9. 用刺激的脾细胞样品用100μl抗体混合物：CD11b PerCP-Cy5.5，CD11c PE-Cy7，CD19 APC-Cy7和CD3 APC（PBSA/az中的1:100 Ab）重悬/染色。
10. 向单染色对照中加入100μlPBSA/az，然后加入1μl每种这些单染色Ab：CD8 FITC，CD8 PE，CD4 PerCP-Cy5.5，CD8 PE-Cy7，CD19 APC-Cy7和CD8 APC。
11. 在冰上在黑暗中（或包装箔）孵育20分钟
12. 加入100μlPBSA/az，然后以1,300rpm旋转5分钟
13. 吸出或闪烁介质。
14. 用100μlBD cytofix/cytoperm溶液重悬于所有孔中
15. 在冰上在黑暗中孵育20分钟。
16. 向所有孔中加入100μl1×BD Perm洗涤（在dH 2 O中稀释10×Perm洗涤）。
17. 以1,300rpm旋转5分钟，然后吸出或轻弹介质
18. 通过向所有孔中上下吹打数次，用200μl1x BD Perm洗涤液重悬/洗涤一次。
19. 以1,300rpm旋转5分钟，然后吸出或轻弹介质
20. 用50μl抗体混合物：TNF FITC和IL-12/IL-23p40PE（1×Perm洗涤中的1:100 Ab）重悬/染色至刺激的脾细胞样品（向单染色对照中加入50μl1x perm洗涤液）。
21. 在冰上在黑暗中孵育30分钟。
22. 向所有孔中加入150μl1x Perm洗涤液，然后以1,300rpm旋转5分钟
23. 吸出或闪烁介质。
24. 用200μl1次Perm洗涤重悬/洗涤一次，上下吹打几次到所有孔
25. 以1,300rpm旋转5分钟，然后吸出或轻弹介质
26. 重悬于最终体积为200μl的1％多聚甲醛溶液（稀释10％多聚甲醛的1×PBS溶液）。
27. 存储在4℃黑暗（或包装在箔），直到准备好流式细胞术（建议存储不超过24小时） - 在FACS之前立即将样品从96孔板转移到滴度管。
流式细胞术
1. 在BD FACS Canto I软件上，选择"新实验"进行设置。
2. 选择面积，高度，宽度的FSC和SSC;选择日志和区域颜色FITC，PE，PerCP/Cy5.5，PE/Cy7，APC/Cy7和APC（在检查器框下）。
3. 创建补偿控制并调整未染色脾细胞的门控（必要时调整FSC和SSC电压）
4. 调整电压面板中单个污渍的每种颜色，使正峰位于10 ⁴标记处。
5. 对于单染色，对于PerCP/Cy5.5使用抗CD4，对于APC/Cy7使用抗CD19，对于FITC，PE，PE/Cy7和APC使用抗CD8，例如参见图1。
  
  图1.单染色对照的实例。用IV-5列出的单个抗体染色脾细胞，并调整电压以得到所描绘的直方图。
6. 在对每个单个污渍和未污染的任何调整后记录所需的电压，然后计算补偿控制
7. 现在可以记录事件 - 设置为收集500,000 - 1,000,000个事件。

食谱

10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1L） 75克NaCl
2克KCl
2g KH sub 2 PO 4 sub
11.5g Na 2 HPO 4
1ml 10N NaOH
pH至7.4，高压釜

1x PBSA /叠氮化物（1 L）
使用ddH 2 O稀释10x PBS至1x PBS 10 g BSA
18ml 5％NaN 3（终浓度= 0.09％叠氮化钠）过滤灭菌

RBC裂解缓冲液
0.15 M NH 4 Cl
1mM NaHCO 3/v/v 0.1mM EDTA溶于无菌灌注水中用1M HCl将pH调节至7.2-7.4 过滤灭菌

培养基
RPMI 1640培养基（含glutamax，HEPES，酚红）
10％FBS
5ml Pen/Strep
5ml 5mMβ-ME

布雷菲德菌素A
接受25mg干粉
溶于乙醇至2 mg/ml，并分装入黑色eppendorf管（光敏）
储存于-20°C

参考文献

Hajjar，A.M.，Ernst，R.K.，Fortuno，E.S.，3rd，Brasfield，A.S.Yay，C.S.，Newlon，L.A.，Kollmann，T.R.，Miller，S.I。和Wilson，人源化TLR4/MD-2小鼠显示LPS识别差异影响对鼠疫耶尔森氏菌的敏感性< 8（10）：e1002963。