材料和试剂

小鼠
0.9％无菌氯化钠（NaCl）（Fresenius Kabi）
盐酸氯胺酮（Ketavet，100mg/ml）（Pfizer）
甲苯噻嗪盐酸盐（Rompun，20mg/ml甲苯噻嗪）（Bayer）
4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（4％Roti-Histofix）（Roth，目录号：P087.1）
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：14170-138）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31434）
将磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4+），7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号： S9390）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 PO 4，H 2 O 2）（Roth，目录号：K300。 2）
氯化钾（KCl）（AppliChem GmbH，目录号：A3582）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 sub）（Gerbu，目录号：2018）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
盐酸（HCl，37％）（Sigma-Aldrich，目录号：30721）
Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
马血清（Biochrom，目录号：S9135）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X-100）
鸡抗GFP抗体（Aves，目录号：GFP-1020）
山羊抗双皮质蛋白抗体（DCX，C18）（Santa Cruz，目录号：sc-8066）
小鼠抗NeuN抗体（EMD Millipore，目录号：MAB377）
驴抗鸡DyLight488抗体（Dianova，目录号：703-485-155）
驴抗山羊Alexa 647抗体（Dianova，目录号：705-605-147）
驴抗小鼠Alexa 546抗体（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：A10036）
Hoechst（33342）（Biotrend，目录号：40047）
明胶涂覆载玻片（Sigma-Aldrich，目录号：G7041）
铬（III）硫酸钾十二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：60152）
溴百里酚蓝钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：114421）
FD Rapid GolgiStain ^TM Kit（FD NeuroTechnologies，目录号：PK401）
微孔水
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459844）
二甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：33817）
Eukitt（Fluka，目录号：03989）
琼脂糖（AppliChem GmbH，目录号：A8963）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（20x）（见配方）
TBS（10x）（参见配方）
TBS ++（参见配方）
0.1 M磷酸盐缓冲液（参见配方）
明胶涂层玻璃载玻片（见配方）
Mowiol（Merck/Calbiochem，目录号：475904）（参见配方）

设备

注射器（1ml注射器，27G用于注射）
0.5 ml Eppendorf Safelock管
15 ml和50 ml Falcon管
微解剖剪刀
镊子
Leica VT1200 Vibratome
刷子传输切片
网络载体和板（Corning Inc.，目录号：3477和3520）
摇台
管滚子搅拌器
热板搅拌器
污渍容器
显微镜玻片
盖玻片
共焦显微镜
离心机

软件

Amira细丝编辑分析（Visage Imaging）或其他神经元形态分析软件

程序

组织制备
1. 经心脏灌注
  在0.9％NaCl中用过量的Rompun（14mg/kg体重）和Ketavet（100mg/kg体重）麻醉动物。小鼠用30ml HBSS，然后用溶解在pH7的0.1M磷酸盐缓冲液中的10ml 4％多聚甲醛（PFA）经心脏灌注。对于经心脏灌注，打开胸腔，用剪刀切割右心耳以允许出血。在左心室中引入蝶形插管，用30ml HBSS灌注小鼠，然后用10ml 4％PFA固定。
  去除脑，并在4ml的管式滚动混合器中的15ml Falcon管中在10ml的4％PFA的0.1M磷酸盐缓冲液pH7中后固定过夜。
  组织用PBS洗涤两次，并且可以在具有0.01％叠氮化钠的PBS中储存长达一年。
未成熟齿状回神经元的神经元形态分析
1. 振动切削
  1. 对于冠状vibratome切片（见图1），小脑被切除，删除，大脑与切割位置使用superglue直接粘贴到vibratome的固定板上。冠状截面可以具有50μm或100μm的厚度注意：NeuN抗体不能很好地穿透100μm厚的切片。如果你必须使用100μm厚的切片，一抗孵育应该是72小时。
  2. 对于矢状切片（参见图1），将脑包埋在PBS中的2％琼脂糖中。然后将脑在固定的凝胶块中胶合到保持器板的侧面上。矢状切面切成100μm厚。琼脂糖可以在切割期间从切片中移除，或者可以在染色过程期间保持，以稳定组织（特别是嗅球）。
  3. 切片可以在含有0.01％叠氮化钠的PBS中在4℃下保存。组织可能在灌注后使用长达一年。
图1.共同颈椎和矢状脑切面（SVZ：室下区; DG：齿状回）的神经源性龛位概述。
1. 免疫荧光染色
  1. 对于每只小鼠，染色4个脑切片（50或100μm厚，分别为250μm或300μm）。将脑切片置于装有补充有8％NaCl（TBS）的4ml 0.1M Tris缓冲液pH7.4的12孔板（每孔2个切片）中的净载体中。将切片在室温下在摇动平台（50rpm）上在TBS中每15分钟洗涤三次。
  2. 通过在RT下在TBS ++中孵育切片1小时进行非特异性抗体结合的阻断
  3. 将切片转移至含有200μlTBS ++和稀释的一抗的0.5ml Eppendorf Safelock管（每管2个切片），并在4℃下孵育24-72小时。为此，将12个管放入50ml Falcon中并在管式滚筒混合器上在4℃下旋转。
    1. 对于基因或反转录病毒标记的未成熟神经元的GFP/YFP染色，切片用原代鸡抗GFP抗体（1：1,000）染色。
    2. 否则，未标记的未成熟神经元用山羊抗双皮质素抗体（1:200）染色。可以使用小鼠抗NeuN（1：200）作为额外的标记物来确定细胞成熟度
  4. 孵育后，将切片转移回12孔板中的网状载体，在室温下用TBS洗涤三次
  5. 在TBS ++中在室温下封闭30分钟后，将切片再次转移到含有在TBS ++中的稀释的二级抗体混合物的0.5ml Eppendorf Safelock管中。将来自Falcons的Eppdorf管中的切片在2℃下在管式滚筒混合器上在二抗中孵育2小时。
    1. 二抗用1:400稀释：驴抗鸡DyLight488，驴抗山羊Alexa 647或驴抗小鼠Alexa 546.
    2. Hoechst 33342（1：10,000）用于复染DNA并加入第二抗体混合物中。
  6. 最后，将切片置于12孔板中的净载体中，用TBS洗涤三次，15分钟，在室温下，在TBS中洗涤另外4次，每次1分钟。
  7. 将切片漂浮在培养皿中的0.1M PB中，固定在载玻片上并用100μlMowiol包埋。
2. 用共聚焦显微镜上的40x物镜拍摄共聚焦显微镜照片。使用Amira Filament Editor Analysis（Visage Imaging）测量分枝点和总枝晶长度
成熟海马神经元的神经元形态分析
1. 为了分析成熟CA或DG神经元的神经元形态，将PFA固定的脑切成两个半球，并用FD Rapid GolgiStain TM试剂盒染色。
  1. 将半球在浸渍溶液（A和B）中在黑暗中室温下孵育2周
  2. 之后，将组织转移到溶液C中，并在4℃避光保存5天
  3. 使用Leica VT1200振动台将组织切割成在溶液C中漂浮的100μm厚的冠状切片，并且安装在涂覆有明胶的载玻片上。为了涂覆载玻片，将1.5g明胶和0.25g硫酸铬钾与500ml蒸馏水混合，加入几种溴百里酚蓝的晶体作为防腐剂，加热至60℃以溶解明胶，然后将载玻片浸入用组织清洁溶液和载玻片的下部。包被的载玻片在RT下干燥过夜
  4. 将装载的载玻片在Millipore水中洗涤2次，每次2分钟。
  5. 切片在室温下在染色溶液（40ml溶液D，40ml溶液E和80ml Millipore水）中染色10分钟。
  6. 将切片在Millipore水中洗涤2×4分钟，在50％乙醇（EtOH）中洗涤4分钟，在75％EtOH中洗涤4分钟，在95％EtOH中洗涤4分钟，在100％EtOH中洗涤4分钟4次在 RT。
  7. 最后，将切片在二甲苯中洗涤3次，每次4分钟，并用Eukitt包埋。
2. 齿状回和CA区的神经元可以用这种方法分析。可以在具有40x物镜的共焦显微镜上记录堆。使用Amira Filament Editor Analysis（Visage Imaging）（参见图2）测量分枝点和总枝晶长度。

代表数据

图2.高尔基体染色神经元的光显微镜（A）和共焦显微镜图片（B）。使用B（左图）所示的图像用于Amira（右图）的图像分析。

食谱

PBS（20x）

NaCl
160 g/L

Na HPO ₄
23克/升

NaH 2 PO 4 sub
28.84克/升

KCl
4 g/L

KH ₂ PO ₄
4 g/L

用HCl调节pH至7.4，用dH 2 O填充体积至1L
TBS（10x）

Trizma基地
24.23克/升

NaCl
80.06 g/L

混合在800毫升超纯水中，用纯HCl调节pH至7.6，并填充至1升
TBS ++

TBS
100 ml

马血清
3 ml

Triton X-100
0.25 ml
0.1 M磷酸盐缓冲液
0.2 M一元股票

NaH 2 2 PO 4 4 ^。 H <2> O
13.9g/500ml

0.2 M二碱基料

lt; sub> 4< sub> ^。 7H O
53.65克/升

合并指示量的0.2M一元和0.2M二元储备溶液，并使体积达到600毫升

0.2 M一元股票
0.2 M二碱基料
pH

57 ml
243 ml
7.4
明胶涂布玻璃载玻片

明胶
1.5 g

铬（III）硫酸钾十二水合物
0.25 g

加入几种溴百里酚蓝色结晶作为防腐剂用H 2 O填充至500ml，加热至60℃以溶解明胶。
Mowiol

1x PBS
40 ml

Mowiol
10克
→搅拌24小时

添加甘油
20ml
→搅拌24小时

在5,000rpm，RT下离心15分钟
等分并存储在-20°C

致谢

该协议改编自Seib等人（2012）。

参考文献

Seib，D.R.，Corsini，N.S。，Ellwanger，K.，Plaas，C.，Mateos，A.，Pitzer，C.，Niehrs，C.，Celikel，T.and Martin-Villalba， Dickkopf-1的缺失可恢复老年人的神经发生并抵消认知衰退。 Cell Stem Cell 12（2）：204-214。