材料和试剂

在Rink酰胺-4-甲基二苯甲基胺盐酸盐（MBHA）树脂上通过Fmoc固相法（Merrifield等人，1982）合成肽。用4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑氟化物（NBD-F）或5-（和-6） - 羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯（罗丹明）进行荧光标记，然后从树脂并通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化。请参阅Oren等人中的详细方法。（1999）和Avrahami等人。（2001）。
脂质体悬浮液母液，总脂质浓度为12.5mM。对于脂质体制备，参见Kliger等人。（1997）
细菌悬浮液（OD <600nm，调节至4）
荧光标记肽溶液（见注1）
双蒸馏水（DDW）或Milli-Q试剂级水
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）
70％（v/v）乙醇
5 x 5 mm石英比色皿

设备

自动肽合成仪ABI 433A（Applied Biosystems）
反相高效液相色谱（RP-HPLC）Agilent HPLC 1100（Hewlett Packard）
SLM-Aminco Bowman系列2-发光分光光度计FA-355（SLM-Aminco）

程序

NBD标记肽与膜的结合
肽的结合常数由脂质囊泡（小单层囊泡（SUV，10-50μm大小）或大单层囊泡（LUV，50-100μm大小）滴定到NBD-肽溶液中计算）。为了获得准确的结果，应为每条曲线记录至少20个点。肽溶液的接受稀释倍数高达10％，因此应当加入不超过40μl的囊泡溶液。所有测定在室温（22-24℃）下进行
1. 将所需溶液（例如DDW或PBS）的NBD肽溶解至终浓度为0.1μM（见注2）。每次测量使用400μl肽溶液，因此准备两个810μl 重复。
2. 将分光光度计设置为具有467nm的激发波长和500-600nm的发射波长的光谱模式。在我们的设备中，狭缝通常设置为5-10 nm。使用更宽的狭缝将改善灵敏度，但是可以增加背景噪声，因此应该对每个肽单独确定。
3. 加入400μl肽溶液到预先清洗的比色皿（磁力搅拌器可以使用），并读取信号输出。每隔几分钟再次测量，直到没有检测到变化。这是在没有膜化合物的情况下标记肽的基础信号
4. 从LUVs悬浮液添加1微升到比色杯，以达到1：312的初始肽/脂质比，并再次读取。计算比率：12.5mM脂质是12,500μM，其在含有0.1μM肽的溶液中以1:400稀释。因此，当加入1μl时，比例为1:312（12,500/401×10）。当另外1μl将被添加的比例将是1：622等等。
5. 每1分钟重新测量信号强度，直到没有检测到信号的变化。这将表明装订已达到平衡。
6. 重复步骤1-d，直到峰最大值（约530nm）没有变化可以检测到
7. 通过用70％（v/v）乙醇洗涤三次来清洁比色杯。比色杯中的痕量乙醇应通过用DDW冲洗除去。
8. 为了考虑背景，应该监测和扣除在相同波长下单独的囊泡的发射。因此，使用相同的溶剂，但不溶解肽，重复步骤1-c〜f
细胞壁渗透性测定
设计该测定法以比较给定肽穿透给定细菌菌株的细胞壁并与其膜相互作用的能力（Saar-Dover等人，2012）。应该计算每个应变的NBD发射的相对高度并进行比较。
1. 生长你的细菌到指数阶段，通过离心5毫升在1,300×g ，从培养浓缩细胞，3分钟。洗涤并用PBS再次离心平板两次。在PBS中将细菌悬浮液调节至OD <600> nm = 4。
2. 将NBD肽溶解在PBS溶液中至终浓度为0.1-1μM（使用不破坏细胞完整性的浓度，这可以使用SYTOX绿色测定法（Saar-Dover等人）。，2012）。
3. 将分光光度计设置为激发波长为467nm和发射波长为530nm的动力学模式。在我们的设备中，SLM-Aminco Bowman系列2-发光分光光度计，狭缝通常设置为5-10nm。使用更宽的狭缝将改善灵敏度，但是可以增加背景噪声，因此应该对每个肽单独确定。
4. 加入400μl肽溶液到预先清洗的比色皿（磁力搅拌器可以使用），读取信号输出，直到它稳定。这是在没有膜化合物的情况下标记肽的基础信号
5. 加入10微升从细菌悬浮液到比色杯。跟踪信号强度随时间的变化，直到达到平衡。
6. 通过用70％（v/v）乙醇洗涤三次来清洁比色杯。比色杯中的痕量乙醇应通过用DDW冲洗除去。
7. 为了考虑背景，应该监测和减去在相同波长下单独的细菌的排放。因此，使用相同的溶剂，但不溶解肽，重复步骤2-c〜e
8. 信号强度可受标记肽在细菌表面上的寡聚化和自淬灭（降低的强度）的影响。因此，我们通过使用罗丹明标记的肽重复实验来评估肽寡聚化的水平。若丹明对淬灭非常敏感，但与NBD不同，其发射不受其环境极性的强烈影响

计算

对于NBD标记的肽与膜的结合：

准备一个滴定结果表 - 发射（Y）与脂质浓度（X）
从每个Y值中减去基线值（仅解决方案）以校正背景
您应该得到饱和曲线，意味着非线性曲线（图1）。使用非线性方程程序解算器（如GraphPad Prism）提取最佳拟合方程。

图1. NBD标记的肽与膜的结合。描述在磷脂酰胆碱：胆固醇（9：1）大单层脂质囊泡（LUV）滴定至0.2μMNBD缀合肽（NBD-gp41 TMD）中时NBD荧光增加的代表饱和曲线。使用非线性最小二乘法分析来确定亲和常数（Ka）。

计算K sub（缔合常数）。您还可以确定饱和时的肽：脂质比例。
或者，一个不太优选但仍然适用的方法是从曲线的线性部分计算斜率，只要该区域至少有10个点。
详情请参阅Rosenfeld 。（2006）。

对于细胞壁渗透性测定：

从细菌加入肽中并且信号稳定后记录的最终发射值减去细菌基础发射
计算（以百分比）细菌的添加相对于基础肽排放增加了多少发射
比较任何给定的细菌菌株（例如野生型与突变体）之间的变化程度以评估给定组分对细胞壁对肽的渗透性的作用。
详情请参阅Saar-Dover 等人。（2012）。

笔记

使用Beer-Lambert方程通过光谱法测定以摩尔单位表示的肽浓度（em）：</em>
其中A em是在467nm（NBD）和在530nm（罗丹明）的实际吸光度。 NBD的摩尔吸光系数（ε）为16000 [cm/M]，罗丹明的摩尔吸光系数为38000 [cm/M]。是以厘米为单位的比色杯路径长度。
实验的肽浓度应该在低微摩尔范围以达到非常低的肽/脂质比，并且还取决于标记和纯化质量。我们通常使用0.1-1μM标记肽的浓度范围

参考文献

Avrahami，D.，Oren，Z.and Shai，Y。（2001）。多种脂肪族氨基酸取代对非对映体膜活性的结构，功能和作用模式的影响肽。生物化学 40（42）：12591-12603
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