材料和试剂

储存在液氮中的新鲜冷冻组织标本
Tissue-Tek O.C.T. （Sakura Finetek Europe B.V.，目录号：4583）
Mayers'haematoxylin
乙醇
二甲苯
液氮或干冰
TRIzol（Life Technologies，目录号：15596-026）或优选的替代性RNA分离方法
糖原（F.Hoffmann-La Roche，目录号：10901393001）
氯仿
异丙醇（异丙醇）
无RNase水

设备

21-26号针
PEN箔2.0μm覆盖载玻片（Leica，目录号：11505158）
50ml带螺旋盖的管（Greiner Bio-one，目录号：210261）
冷冻切片机（在冷冻切片环境中的旋转切片机）
徕卡激光显微切割系统（AS LMD，型号：LMD6500或LMD7000）
离心机
-80°C冰箱用于样品存储

程序

在整个程序中对RNA处理采取所有必要的预防措施。
1. 始终戴上手套。
2. 只使用无RNase设备，塑料和试剂
用紫外线预处理PEN箔片15分钟以减少静电。
注意：我们使用50 Hz和26 W的紫外线源。
从冷冻的组织标本（嵌入Tissue-Tek）中切出8-10μm厚的切片，并将切片直接施加到载玻片的PEN箔覆盖侧。
注意：
1. 根据样本的大小，可以将多个部分应用于同一张幻灯片。
3. 始终保持干燥和冷却（储存在密闭的50ml管中，在-80℃下，在液氮或干冰中运输）。
4. 此外，可以制备用于标准H& E染色的4μm切片，以允许由病理学家或其他专家划分感兴趣的组织区域/细胞。
含有组织切片的玻片应储存在封闭的50ml管中并保持冷（在-80℃保存并在液氮或干冰中运输）。
注意：使用50ml管避免在载玻片上冷凝，从而保持组织干燥，从而减少RNA降解。
在室温（RT）下用Mayers的苏木精染色1分钟注意：
1. 在染色之前，让载玻片进入RT，同时仍然在封闭的50ml管中。
2. 小心不要丢失组织切片。染色最好通过直接在载玻片上吸取苏木精来进行。
小心冲洗无菌（无RNA酶）水滑梯。
通过随后在50％，70％和100％乙醇中漂洗1分钟（可在50ml管中进行）和在二甲苯中培养8分钟（使用玻璃容器）来脱水组织切片。
将载玻片置于密闭的50ml管中，在-80°C或继续显微切割
添加一点（10-20微升）TRIzol到管帽，其中显微切割组织将下降。
注意：
1. 在开始显微切割术之前，让玻片在50毫升管中达到室温。
2. 如果选择其他RNA分离方法，TRIzol应该替换为该方法中使用的第一个试剂。
使用以下设置，以10倍放大率（参见图1），从载玻片上显微解剖感兴趣的所有区域/细胞：
强度：46
速度：5（或更低）
偏移：5
孔径差：6

图1.子宫颈组织切片的实例图片在发育不良的上皮的激光捕获显微切割后 e（上图）和之后（下图）。帽子中的显微切割组织显示在左侧面板中。
添加另一个80-90微升的TRIzol（或替代分离试剂）到含有显微切割的组织和转移组织和TRIzol /替代隔离试剂的0.2毫升管到1.5毫升管。注意：如果研究者喜欢，可以使用另一种RNA分离方法。但是，此协议已使用TRIzol优化。
向管中加入TRIzol，得到总体积为1ml 注意：储存于-80°C或继续RNA分离。
加入1μl糖原并混匀（涡旋10秒钟）
破坏组织/细胞，并剪切基因组DNA与10通过21-26规格的针
加入0.2ml氯仿并涡旋30秒
在室温下全速旋转5分钟（12,000×g ）。
将水相转移到干净的管中
向水相中加入0.5ml异丙醇，充分混合
在-20°C孵育样品至少1小时，以获得最佳的RNA沉淀
在室温下全速（12,000
丢弃上清液
注意：小心不要打扰含有RNA的沉淀。
用200μl70％乙醇洗涤沉淀。
在室温下全速旋转10分钟。
弃去上清液。
重复步骤20-22。
注意：这一次，彻底清除上清液很重要。
对球团造粒。
注意：如果在步骤23中移除的所有上清液，这只需要几分钟。
用10-30μl无RNA酶的水重悬沉淀
储存于-80°C。

致谢

该方案在Elza de Bruin（de Bruin等人，2005年）和Muriel Verkuijten的帮助下进行了优化。这项工作得到了荷兰基因组倡议，荷兰皇家艺术和科学学院，VUMC-CCA研究所的VU大学医学中心，荷兰阿姆斯特丹（授权号码）框架下的医疗系统生物学中心（CMSB） CCA20085-04）和荷兰癌症协会（KWF，授权号VU2010-4668）。

参考文献

de Bruin，EC，van de Pas，S.，Lips，EH，van Eijk，R.，van der Zee，MM，Lombaerts，M.，van Wezel，T.，Marijnen，CA，van Krieken，JH，Medema， JP，van de Velde，CJ，Eilers，PH和Peltenburg，LT（2005）。宏观解剖与直肠癌的显微解剖：基质细胞对肿瘤细胞基因表达谱的微小影响。 a> BMC 6：142
Wilming，SM，de Wilde，J.，Meijer，CJ，Berkhof，J.，Yi，Y.，van Wieringen，WN，Braakhuis，BJ，Meijer，GA，Ylstra，B.，Snijders，PJand Steenbergen，RD 2008）。集成的基因组和转录谱可识别宫颈癌中基因表达改变的染色体基因座。 Genes Chromosomes Cancer 47（10）：890-905。
Wilming，SM，Snijders，PJ，Verlaat，W.，Jaspers，A.，van de Wiel，MA，van Wieringen，WN，Meijer，GA，Kenter，GG，Yi， R.，Meijer，CJ和Steenbergen，RD（2013）。与染色体变化相关的改变的微小RNA表达有助于宫颈癌发生。 Onc ogene 32（1）：106-116。