材料和试剂

物种
使用三种小球藻物种：<普通，从利文斯顿岛，南设得兰群岛，南极的土壤样品中分离; C。 vulgaris 菌株8/1，于1968年从保加利亚Rupite地区的温泉泉中分离，并自1975年在我们的实验室中栽培，并且从Trebon收集中孵化出嗜热菌。
栽培
在60μmol/m 2 s/s的连续光下和在23℃±0.1℃的温度下，在TAP（Tris Acetate Phosphate）培养基中培养小球藻属物种Phytotron GC 400生长室。该种在该温度下培养，因为众所周知，热的藻类可以在宽的温度范围内生长。
兔多克隆抗体HSP70B细胞质（Agrisera，目录号：AS06 175）
山羊抗兔IgG（H& I）HRP缀合的（Agrisera，目录号：AS09 602）
考马斯亮蓝G 250
正磷酸（Valerus，目录号：N 4420）
三氯乙酸（TCA）
牛血清白蛋白（BSA）（Applichem GmbH，目录号：1391 0025）
白蛋白级分V（pH 7.0）
中纯硝酸纤维素（NCM）（0.45μm）（Bio-Rad Laboratories，目录号：162-0115）
过滤纸
海绵
4CN（4-氯 - 萘酚）（Bio-Rad Laboratories，目录号：N170-6535）
N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Alfa Aesar，目录号：N12536）
Laemmli样品缓冲液（参见配方）
布拉德福的试剂（见食谱）
5x Laemmli缓冲区（参见配方）
运行缓冲区（参见配方）
传输缓冲区（请参阅配方）
SDS-PAGE凝胶（参见配方）
30％丙烯酰胺/N，N' - 亚甲基双丙烯酰胺（AA/MBA）（参见配方）< br /
10％SDS（见配方）
10％过硫酸铵（见配方）
1.5 M Tris HCl缓冲液（pH 8.8）（参见配方）
1.0 M Tris HCl缓冲液（pH 6.8）（参见配方）
4 M NaCl（见配方）
1.0 M Tris HCl缓冲液（pH 7.5）（参见配方）
20％Tween 20（见配方）
阻止缓冲区（参见配方）
染色溶液（见配方）
5％CH 3 COOH（参见配方）
洗涤液（见配方）
50 mM TBS-T缓冲液（见配方）
HRP颜色开发解决方案（参见配方）

设备

电机
硅胶石英砂0.6mm（Valerus，目录号：N1760）
离心机（Sigma-Aldrich，型号：1-15K）
电泳室转移单元Hoefer miniVE电泳和电转移单元（Hoefer，型号：SE300-10A-1.0）
迷你摇床振动器MR-1

软件

Image J程序

程序

I. 细胞裂解

向沉淀物中加入100μl的Lisys溶液（LS）（Chankova等人，2013b）转移至冷冻的研钵，加入两个硅砂沙，在研钵中研磨3分钟，加入200μl LS在砂浆中洗涤并将材料转移到2ml的Eppendorf管中。
将步骤1的材料以14,500×g离心10分钟。
分离上清液，在t = 90°C加热上清液5分钟。
在14,500×g离心5分钟。
将上清液分成2个样品：第一个用于测定蛋白质浓度; 第二个保持在t = -20°С。

II。蛋白质浓度的测定（Bradford）

加入30μl20％TCA到30μl上清液。
在14,500×g离心5分钟。
向沉淀中加入60μl0.1N NaOH，充分混合。为了获得最佳结果，加入30μl0.1N NaOH两次。
取14μl，加入86μl0.15μlNaCl和3 ml Bradford试剂。

使用蛋白质量的校准曲线（表1）对于校准曲线：
储备溶液 - 0.5mg/ml BSA
使用表1确定每个点的标准曲线加入3ml试剂的Bradford。

表1.蛋白质量的校准曲线

N	BSA（μg）	BSA（0.5mg/ml）vol（μl）	NaCl（0.15M）vol（μl）
1	0	0	100
2	5	10	90
3	10	20	80
4	15	30	70
5	20	40	60
6	25	50	50
7	30	60	40
8	35	70	30
9	40	80	20
10	45	90	10
11	50	100	0

III。蛋白电泳

将大约100 ml的1x Laemmli缓冲液放入电泳模块的比色杯中。
取出梳子，用SDS-PAGE凝胶缓冲液冲洗孔。
每孔加入10μg蛋白质：调节体积，加入等量的蛋白质（例如：10μl样品中含有10μg蛋白质）。
将剩余的缓冲液放入电泳槽的浴槽中（体积必须始终高于最小值）。
使用以下参数进行电泳：120V和16mA，3.5小时
电泳完成后，小心取出凝胶。
注意：删除样本的顺序。应释放浓缩凝胶。

IV。蛋白质在NCM上的转移

在缓冲液中浸泡凝胶15分钟。
在转移缓冲液中浸泡海绵和三明治的滤纸
剪切NCM。尺寸应该是诸如凝胶的尺寸。将NCM在转移缓冲液中放置5分钟。
注意：标记膜上样品的顺序！用铅笔标记膜。
做一个三明治。
1. 该堆叠组装在黑色阴极侧（参见图1）：
  1. 将包装海绵置于黑色阴极侧。
  2. 将包装海绵放置在黑色catode（a）上。
  3. 在海绵上放置一张湿滤纸（b）。
  4. 将平衡凝胶放在滤纸（c）上。
  5. 将膜置于凝胶（d）上。
  6. 在膜（e）上放置一张湿滤纸。
  7. 在滤纸（f）上放置两个包装海绵。
  8. 如果添加了第二个转移堆叠，则放置在这两个海绵之间。
    
    图1. 组装转移堆栈（ t his是从www。hoeferinc.com ）
2. 不同部位的三明治压力很好，以避免气泡。
3. 三明治的不同部分应该很好地润湿。你可以用管子"滚动"他们。
  1. 关闭设备。放入腔室转移缓冲液。
  2. 使用以下参数进行印迹：35V和250mA，持续2小时

V. 蛋白质印迹

蛋白转移后，将膜置于封闭缓冲液中t = 4°C。在摇摆平台上孵育1小时（按照此步骤，我们获得了最佳结果）。
将凝胶放在染色溶液中4-5小时
用洗涤液洗涤凝胶3-4小时。
在封闭缓冲液（1：10,000）稀释初级抗体，根据制造商的说明孵育。在摇床平台上在t = 4℃过夜孵育
以下列方式在摇床平台上的TBS-T缓冲液中洗膜：2分钟（2×2分钟），2次，10分钟（2×10分钟）。
在封闭缓冲液（1:20,000）中制备二抗，并根据制造商的说明进行孵育。在室温下摇动平台孵育2小时。
在摇床平台上的TBS-T缓冲液中以以下方式洗涤膜：两次2分钟（2×2分钟），然后三次，5分钟（3×5分钟）。
使用HRP显色解决方案，4CN根据制造商的说明可视化。
扫描膜。使用Image J程序计算蛋白质量。

食谱

Laemmli样品缓冲区
2％SDS
5％2-巯基乙醇 10％甘油 0.002％（w/v）溴酚蓝
62.5mM Tris HCl（pH6.8）
Bradford的试剂
在搅拌器中溶解100mg考马斯亮蓝G 250和50ml 96％的醇15分钟。加入94.5ml 90％正磷酸。
加入900ml去离子H 2 O并轻轻搅拌。
通过折叠的滤纸过滤，并用去离子水补足至1L。
保存在冰箱中t = 4°C。
5x Laemmli缓冲区
15克TRIS基地
72g甘氨酸在1L去离子H 2 O中
运行缓冲区
将200ml 5x Laemmli缓冲液+ 10ml 10％SDS加入到1L去离子H 2 O中。
传输缓冲区
将200ml 5x Laemmli缓冲液+ 2ml 10％SDS加至+ 200ml乙醇至1L去离子H 2 O中。

SDS-PAGE凝胶
注意：在制备SDS-PAGE凝胶之前，玻璃砖应用酒精彻底清除。

分离凝胶（12.5％）（表2）

表2.制备分离凝胶溶液

微型凝胶数量	1	2
去离子H 2 O 2 /	3.2 ml	6.4 ml
Acrilamide/bisacrilamide（30％）	4 ml	8.0 ml
1.5M Tris HCl缓冲液，pH 8.8	2.6 ml	5.2 ml
10％SDS	100微升	200μl
10％APS	100微升	200μl
TEMED	10微升	20微升

非常仔细地混合组分在一个50ml Falcon管，以避免气泡。
在室的两块玻璃板之间插入分离凝胶（在砖的边界下约1cm）
使用注射器小心地加入去离子H 2 O 2作为薄膜，并等待约15分钟
小心取出水; 用滤纸擦拭两端的水滴。

堆叠凝胶（表3）

表3.准备4％堆积胶溶液

微型凝胶数量	1	2
去离子H 2 O 2 /	1,370μl	2,740μl
Acrilamide/bisacrilamide（30％）	330微升	660μl
1.0M Tris HCl缓冲液，pH 6.8	250微升	500微升
10％SDS	20微升	40微升
10％APS	20微升	40微升
TEMED	2微升	4微升

放入浓缩的凝胶，插入梳子，等待凝胶聚合。
对于电泳更好是准备约1,250ml 1x Laemmli缓冲液。它可以使用两次。

30％AA/MBA
将29.0g + 1.0g MBA溶解在72.5ml去离子H 2 O中，使体积达到100ml，使用0.45μm过滤器进行过滤
保持在t = 4°C小于1个月。
10％SDS
将10g SDS溶解在100ml去离子H 2 O中
10％过硫酸铵
将1g溶解在10ml去离子H 2 O中保持在t = 4°C小于1个月。
1.5M Tris HCl缓冲液，pH 8.8
将18.5g Tris碱溶解在80ml去离子H 2 O中，用浓HCl调节至pH = 8.8，并将体积补足至100ml。
1.0 M Tris HCl缓冲液pH 6.8
将12.114g Tris碱溶解在80ml去离子H 2 O中，用浓HCl调节至pH = 6.8，并将体积补至100ml。
50mM TBS-T缓冲液
1.0M Tris HCl缓冲液（pH7.5） 200 mM NaCl
0.1％Tween 20
4 M NaCl
将23.376g NaCl溶解在100ml去离子H 2 O中
1.0M Tris HCl缓冲液（pH7.5）将12.114g TRIS碱溶解在80ml去离子H 2 O中，用浓HCl调节至pH7.5，并补足至100ml。
20％Tween 20
将20ml吐温补足至100ml去离子H 2 O
阻塞缓冲区
将5％无脂奶粉溶于100 ml TBS-T缓冲液中。
染色溶液
0.2％考马斯亮蓝R-250
40％C 2 H 5 OH
5％CH 3 COOH v/v 将2g考马斯亮蓝R-250,400ml C 2 H 5 OH和50ml CH 3 COOH溶解并补足至1L 用去离子H 2 O 2
洗涤溶液
40％C 2 H 5 OH
5％CH 3 COOH v/v
HRP色彩开发解决方案
将60mg的4-氯 - 萘酚溶于20ml甲醇中。
使用前立即溶解并保护溶液免受光照。
在即将使用前，向60ml TBS中加入60μl冰冷的30％H 2 O 2 Sub 2。在室温下混合两种溶液。立即使用。

参考文献

Chankova，S.，Mitrovska，Z.，Miteva，D.，Oleskina，Y.P.和Yurina，N.P。（2013a）。热休克蛋白HSP70B作为基因型对环境压力的标记，在小球藻中 >来自对比生境的物种。 Gene 516（1）：184-189。
Chankova，S.，Mitrovska，Z.和Yurina，N。（2013b）。热休克治疗（Chlamydomonas reinhardtii）和小球藻细胞。生物协议 3（15）：e849。
Chankova，S.G.，Yurina，N.P.，Dimova，E.G.，Ermohina，O.V.，Oleskina，Y.P.，Dimitrova，M.T.and Bryant，P.E。（2009）。用热预处理不会影响双链断裂重新结合在莱茵衣藻中的DNA 。 J Thermal Biol 34（7）：332-336。