材料和试剂

革兰氏阴性菌（该方案是为大肠杆菌开发的，但它也适用于其他物种）
甲醛（FA）（Sigma-Aldrich，目录号：47608）
戊二醛（GA）（Merck KGaA，目录号：1-04239-0250）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416-100ml）
Triton X-100（Merck KGaA，目录号：1.08643.1000）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：ED255）
溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）注意：将溶菌酶以100μg/ml溶解在含有5mM EDTA的PBS pH7.2中，准备使用1ml等分试样并储存在-20℃下。
封闭试剂（F.Hoffmann-La Roche，目录号：1096176））
Cy3-AffiniPure驴抗兔IgG（H + L）（Jackson ImmunoResearch，目录号：711-165-152）
注意：对牛，鸡，山羊，几内亚，猪，叙利亚仓鼠，马，人，小鼠，大鼠和绵羊血清蛋白的最小交叉反应。将缓冲液冷冻干燥的Cy3标记的二抗溶解于H 2 O中至终浓度为1.5mg/ml，并等分为20μl样品。一旦解冻，二抗在4℃下储存。一个月后从-20°C取新的样品。
PBS缓冲液（pH 7.2）（参见配方）

设备

振荡孵化器以生长细菌
500μl或1ml管（Eppendorf）
50ml管（Greiner Bio-One GmbH，目录号：227261）（备选Sorval SS34管）
Eppendorf离心机5804 R（SS32转子的备用离心机）
Eppendorf离心机（冷却）
摇匀培养箱用于eppendorf管

程序

细胞的渗透
1. 大肠杆菌细胞（LMC500菌株）在28-42℃下在培养基中生长，并如下固定在2.8％FA和0.04％GA中：12.2ml培养物，OD 450，通过加入1ml 37％FA和21μl25％GA的预混合物，在用于生长的水浴中振荡的同时混合0.2（或0.3的OD 600）。将培养物转移到50ml Greiner离心管中注意：建议保持OD <600>低于0.3以在富培养基中实现最佳指数生长，并且将OD <450> <0.2低于最低培养基。
2. 在室温（RT）下保温15分钟，并在室温下以4000xg离心10分钟。
3. 在1体积PBS（pH 7.2）中洗涤细胞一次。
4. 重悬于150μlPBS pH 7.2的沉淀，并将细胞转移到500微升Eppendorf管
5. 通过在4,500×g（7,000rpm）离心5分钟（RT或4℃）沉淀细胞并在150μlPBS（pH7.2）中洗涤两次。细胞可以在4℃下储存长达一个月。
6. 所有后续步骤以150μl（也可能较少）进行，并且所有离心步骤在室温或4℃下以4500rpm×7,000rpm离心5分钟。
7. 孵育细胞在0.1％Triton X-100/PBS pH 7.2在室温下静置45分钟
8. 在PBS（pH 7.2）中洗涤细胞三次。
9. 在室温下将细胞在含有100μg/ml溶菌酶和5mM EDTA的PBS（pH7.2）中孵育45分钟（或在细胞壁突变体的情况下为30分钟）。
10. 在PBS（pH 7.2）中洗涤细胞三次。
标签程序
1. 通过将细胞在PBS（pH 7.2）中的0.5％（w/v）封闭剂中静置或摇动在37℃下孵育30分钟来封闭非特异性结合位点。
2. 与初级抗体孵育（规则为比免疫印迹所需浓度高10倍），在封闭缓冲液中稀释，在37℃下在振荡培养箱中孵育1-2小时（最小培养时间30分钟，在4℃下最大孵育时间过夜取决于对抗体）
3. 在含有0.05％（v/v）Tween-20的PBS（pH 7.2）中洗涤细胞三次
4. 与在37℃下在封闭缓冲液（1:600）中稀释30分钟的第二抗体驴-α-兔-CY3（保证没有与大肠杆菌交叉反应）孵育30分钟。
  注意：将抗体在封闭溶液中以最大速度离心1分钟，以除去染料团块，然后将其加入细胞。
5. 在150μlPBS（pH 7.2）/0.05%Tween-20中洗涤细胞三次
6. 在150μlPBS中洗涤细胞一次。
7. 将细胞重悬在PBS中。
  注意：
  1. 调整体积至细胞量（通常为20微升），即细胞浓度应足够高以进行显微镜分析。
  2. 通过使用与上述相同的程序将血清与具有缺失的基因的菌株孵育，可以非常方便地将大肠杆菌蛋白质与污染性IgG分离。随后，将未结合的IgG用于与野生型菌株的孵育。如果感兴趣的蛋白质是必需的，则血清必须针对纯蛋白质进行亲和纯化。

笔记

固定细菌培养物（通过甲醛/戊二醛或通过乙醇或甲醇），其对于免疫标记过程是必需的，给细胞提供渗透压休克。膜结合或膜相关蛋白或胞质蛋白的定位不受渗透压休克的影响。然而，在周质中自由扩散蛋白可以在固定期间被冲击到细胞极点。因此，我们建议通过分析荧光蛋白融合与这些蛋白质的联合生命成像的本地化验证周质自由扩散蛋白质的本地化。

食谱

PBS缓冲液（pH7.2）（每L）
140mM NaCl 27 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4 sub缓冲液。 2H 2 2mM KH 2 PO 4 sub/
注意：PBS应始终超级消毒。

致谢

所描述的方案已经用于以下出版物：Blaauwen等人（1999）; Aarsman 。（2005）; Potluri et al。（2010）; Typas 等人（2010）; Banzhaf 等。（2012）; van der Ploeg等人（2013）和Egan等人（2014）。

参考文献

Aarsman，M.E.，Piette，A.，Fraipont，C.，Vinkenvleugel，T.M.，Nguyen-Disteche，M.andde Blaauwen，T。（2005）。大肠杆菌分裂的成熟分两步进行。 Mol Microbiol 55（6）：1631-1645。
Banzhaf，M.，van den Berg van Saparoea，B.，Terrak，M.，Fraipont，C.，Egan，A.，Philippe，J.，Zapun，A.，Breukink，E.，Nguyen-Disteche，，den Blaauwen，T。和Vollmer，W。（2012）。肽聚糖合酶在细菌细胞延长中具有活性的协同性。 Mol Microbiol 85（1）：179-194。
Den Blaauwen，T.，Buddelmeijer，N.，Aarsman，M.E.，Hameete，C.M。和Nanninga，N。（1999）。 FtsZ大会在大肠杆菌中的定时。 J Bacteriol 181（17）：5167-5175。
Egan，AJ，Jean，NL，Koumoutsi，A.，Bougault，CM，Biboy，J.，Sassine，J.，Solovyova，AS，Breukink，E.，Typas，A.，Vollmer，W。和Simorre， 2014）。外膜脂蛋白LpoB跨越周质以刺激肽聚糖合酶PBP1B 。 Proc Natl Acad Sci U S A 111（22）：8197-8202。
Hocking，J.，Priyadarshini，R.，Takacs，C.N.，Costa，T.，Dye，N.A。，Shapiro，L.，Vollmer，W。和Jacobs-Wagner，C。重量克分子渗透浓度依赖性将青霉素结合蛋白PBP2转移到新月柄杆菌中的分裂位点。 J Bacteriol 194（12）：3116-3127。
Potluri，L.，Karczmarek，A.，Verheul，J.，Piette，A.，Wilkin，JM，Werth，N.，Banzhaf，M.，Vollmer，W.，Young，KD，Nguyen-Disteche， den Blaauwen，T。（2010）。 PBP5的腹膜和侧壁定位，大肠杆菌的主要D，D-羧肽酶，需要底物识别和膜附着。 Mol Microbiol 77（2）：300-323。
Typas，A.，Banzhaf，M.，van den Berg van Saparoea，B.，Verheul，J.，Biboy，J.，Nichols，RJ，Zietek，M.，Beilharz，K.，Kannenberg，K.，von Rechenberg ，M.，Breukink，E.，den Blaauwen，T.，Gross，CA和Vollmer，W。（2010）。外膜蛋白对肽聚糖合成的调节细胞 143（7）：1097-1109。
van der Ploeg，R.，Verheul，J.，Vischer，N.O.，Alexeeva，S.，Hoogendoorn，E.，Postma，M.，Banzhaf，M.，Vollmer，W.andde Blaauwen，在大肠杆菌中的制备性细胞分裂阶段期间细长体和分裂体之间的共定位和相互作用。/em> Mol Microbiol 87（5）：1074-1087。