图1.不同纯化级分和蛋白质粗提物的酶谱分析的蛋白酶抑制剂活性。在SDS-PAGE后进行酶谱。将1微克蛋白质加载到每个泳道。 CE：粗提取物; QS：来自阴离子交换层析（Q-sepharose）的部分; 级分35-36：在尺寸排阻色谱（Superdex 200）后获得。 M：分子标记。箭头表示抑制活性。

材料和试剂

蛋白质提取物或纯化蛋白（1-5μg）
抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A-3886）
枯草杆菌蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：P-5380）
30％丙烯酰胺原液（29:1丙烯酰胺：双丙烯酰胺）（Bio-Rad Laboratories）
TEMED（Sigma-Aldrich）
过硫酸铵（Bio-Rad Laboratories）
SDS（Bio-Rad Laboratories）
Tris碱（Sigma-Aldrich）
明胶（Sigma-Aldrich）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）
甘氨酸（Sigma-Aldrich）
EDTA（JT Baker）
甘油（JT Baker）
预先染色蛋白标准品（Bio-Rad Laboratories）
考马斯蓝G250（Sigma-Aldrich）
乙醇（JT Baker）
磷酸（Sigma-Aldrich）
Triton X-100（Sigma-Aldrich）
分离凝胶缓冲液（8x）（参见配方）
堆叠胶缓冲液（4x）（参见配方）
明胶SDS-PAGE分离凝胶（参见配方）
堆叠胶（见配方）
样品加载缓冲液（参见配方）
Laemmli水库缓冲区（参见配方）
染色溶液（4 L）（参见配方）

设备

蛋白质微型凝胶盒（Bio-Rad Laboratories）
电源
轨道振动器
孵化器

程序

明胶SDS-PAGE凝胶的制备
1. 清洁并完全干燥玻璃板，梳子，垫片（0.75-1 mm），然后组装凝胶盒
2. 通过加热将1％明胶溶于dH 2 O中，并保温以避免胶凝。
3. 制备12.5％分离凝胶，用明胶溶液代替相应体积的水至终浓度为0.1％。混合好并快速转移到流延室，以避免明胶的不均匀胶凝。在聚合之前加入小层水或异丙醇以使凝胶变平。
4. 一旦凝胶聚合，除去水或异丙醇层并通过使用滤纸尽可能干燥。准备并将堆叠溶液倒入浇铸室并插入梳子
5. 样品制备。
6. 向待测试的每种蛋白质提取物中加入相同体积的2x蛋白质样品上样缓冲液，并混合。不要随时加热。
7. 使用基于蛋白质的蛋白酶抑制剂作为反应的阳性对照，例如：枯草杆菌蛋白酶的抑肽酶或胰蛋白酶的胰蛋白酶抑制剂，并以与测试的蛋白质样品相似的浓度加载它。
电泳。在4℃下在100V下进行约2.5小时。
从凝胶中除去SDS。凝胶中的SDS可能干扰待测试的蛋白酶抑制剂的活性，因此在用蛋白酶处理凝胶之前必须从凝胶中除去。去除通过以下步骤进行：
1. 用30ml 2.5％（v/v）Triton X-100溶液冲洗两次，每次搅拌10分钟。
2. 用30ml 2.5％（v/v）Triton X-100 + 50mM Tris-HCl（pH7.4）溶液冲洗两次，每次搅拌10分钟。
3. 用30ml 50mM Tris-HCl（pH 7.4）冲洗10分钟，同时搅拌。
对于蛋白质消化，在37℃下，在含有1.4U枯草杆菌蛋白酶在50ml 50mM Tris-HCl（pH 7.4），200mM NaCl的缓冲溶液中孵育凝胶2小时。
对于固定，将凝胶置于10％甲醇，10％乙酸溶液中，轻轻摇动30分钟。舍弃解决方案。
蛋白水解抑制剂的检测。用考马斯亮蓝染色凝胶，通过加入约100ml染色溶液，并将其留在轨道振荡器中过夜。弃去污渍，用水冲洗凝胶，直到背景凝胶变得澄清，这表明共聚明胶的有效降解。染色条带的存在表明通过蛋白酶抑制剂的活性（因此"保护条带"）保护明胶免于降解的区域。
通常，缺少明胶的双凝胶作为对照平行进行
如果用于测试的蛋白酶抑制剂的抗体可用，则可以转移消化的凝胶并进行免疫印迹测定。

食谱

分离凝胶缓冲液（8x）
3 M Tris-HCl（pH 8.8）
堆叠凝胶缓冲液（4x）
0.5M Tris-HCl（pH 6.8）

明胶SDS-PAGE分离凝胶
加入以下溶液（总体积：5ml）

30％丙烯酰胺/双丙烯酰胺	2.08 ml
dH 2 2 O	1.72 ml
分离凝胶缓冲液（8x）	0.625 ml
20％SDS	25μl
1％明胶溶液	0.5 ml
10％过硫酸铵	25μl
TEMED（在倾倒凝胶之前添加）	5微升

堆积凝胶（总体积：2.5ml）

30％丙烯酰胺/双丙烯酰胺	0.5 ml
dH 2 2 O	1.375 ml
堆叠凝胶缓冲液（4x）	0.625 ml
20％（w/v）SDS	15微升
10％过硫酸铵	15微升
TEMED	5微升

样品加载缓冲区
0.12 M Tris
10％2-巯基乙醇 20％（v/v）甘油 2mg/ml溴酚蓝
Laemmli水库缓冲区
25 mM Tris碱
0.192 M甘氨酸
0.1％（w/v）SDS
pH约为8.3
不需要调整
在室温下贮存
染色溶液（4L）

考马斯蓝R250
3.2克

乙醇
800 ml

磷酸
64 ml

硫酸铵
320克

将考马斯蓝G250溶解在乙醇中，加入磷酸。将硫酸铵溶解在水中并加入到混合物中。用水调节最终体积。

致谢

该协议改编自Jimenez-Duran等人（2013）。

参考文献

Jimenez-Duran，K.，McClure，B.，Garcia-Campusano，F.，Rodriguez-Sotres，R.，Cisneros，J.，Busot，G.and Cruz-Garcia， NaStEP：一种对自身不相容性至关重要的蛋白酶抑制剂和HT-B稳定性的正调节剂 em> Nicotiana alata 花粉管。植物生理学 161（1）：97-107。
Laemmli，U.K。（1970）。在噬菌体T4头部装配过程中切割结构蛋白。自然 227（5259）：680-685
Lantz，M.S.and Ciborowski，P。（1994）。用于检测和表征微生物蛋白酶的酶谱技术方法Enzymol em> 235：563-594。