材料和试剂

酵母菌株（酿酒酵母）
D-赤藓 - [4,5-，3 H] - 二氢鞘氨醇（[3 H] DHS）（60Ci/mmol）（American Radiolabeled Chemicals，目录号：ART -46）
氟化钠（NaF）（Sigma-Aldrich，目录号：S1504）
叠氮化钠（NaN 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
玻璃珠（0.5mm）（Yasui Kikai，目录号：YGB05）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：05-3400）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：19-2410）
1-丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：03-4560）
氢氧化铵（Sigma-Aldrich，目录号：221228）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：01-0280）
薄层色谱法硅胶60（TLC板）（铝板20×20cm）（Merck KGaA，目录号：105553）
N <2>气体
蒸馏水（H 2 O）
葡萄糖（D-葡萄糖）（Sigma-Aldrich，目录号：07-0680）
酵母提取物（Oriental Yeast，目录号：OYC42008000）
聚胨（Wako Chemicals USA，目录号：513-76611）
无氨基酸和硫酸铵的酵母氮源（BD Difco ^TM，目录号：233520）
腺嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：A9126）
亮氨酸（Nacalai Tesque，目录号：20327-62）
组氨酸（Nacalai Tesque，目录号：18116-92）
赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L5626）
尿嘧啶（Nacalai Tesque，目录号：35824-82）
硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A2939）
色氨酸（Nacalai tesque，目录号：35607-32）
酵母提取物 - 蛋白胨葡萄糖（YPD）液体培养基（参见配方）
合成最小葡萄糖（SD）液体培养基（见配方）
水饱和的1-丁醇（参见配方）

设备

氚敏感成像板（Fujifilm，目录号：BAS-TR2040）
微量离心管
摇动培养箱（TAITEC，型号：BR-43FL ^。 MR）
摇摆式离心机（TOMY，型号：LC-201）
微量离心机（TOMY，型号：MX-301）
水浴摇动器（TAITEC，型号：PERSONAL-11）
浴式超声波清洗机（AS ONE，型号：US-2R）
压力气体吹浓缩器（EYELA，型号：MGS-2200）
TLC显影槽
吹风机
FLA-7000成像系统（GE Healthcare Life Sciences，型号：Typhoon FLA 7000）

软件

FLA-7000图像软件（ImageQuant TL分析）

程序

细胞培养和代谢标记
1. 在25℃下在YPD液体培养基中接种酵母细胞，在175-200rpm下回转振荡过夜
2. 用SD液体培养基稀释培养物至0.01-0.02的OD 600，并在175-200rpm下回转振荡培养过夜。
3. 当培养物的OD <600>为0.2-0.6时，将培养物转移到50ml锥形管中。
4. 在室温（RT）下通过摇摆式离心机在2,000×g下旋转酵母细胞5分钟并除去上清液。
5. 将沉淀重悬于20ml SD液体培养基中，在室温下以2,000xg离心5分钟，除去上清液。重复此步骤至少三次。
6. 将细胞悬浮在SD液体培养基中，使OD 600达到20，并将0.5ml细胞悬浮液转移到新的50ml锥形管中。
7. 在25℃下伴随摇动孵育20分钟
8. 向细胞培养物中加入4μCi的[3 H] DHS，并在25℃下伴随振荡孵育1-4小时。如果需要，在标记之前加入脂质合成抑制剂。
脂质提取和碱水解
1. 为了停止代谢标记，在冰上冷却50ml锥形管，并加入250mM NaF和250mM NaN 3至终浓度为10mM。
2. 将标记的培养物转移到1.5ml微量离心管（管＃1）
3. 通过微量离心机在4℃下以20,000×g收集酵母细胞5分钟，除去上清液并将酵母细胞重悬于1ml冷水中。重复此步骤至少三次。
4. 用冷水将细胞悬液的体积调节至66μl，并涡旋振荡
5. 加入0.3g玻璃珠，低温涡旋（涡旋30秒，在冰上冷却1-2分钟，重复至少三次）。
6. 加入440μl氯仿 - 甲醇（CM; 1/1，v/v），涡旋并在室温下以20,000xg离心5分钟。
7. 将上清液转移到新的1.5ml微量离心管（管＃2）
8. 为了提取管＃1中剩余的放射性标记的脂质，在管＃1中加入200μl氯仿 - 甲醇 - 水（CMW; 10/10/3，v/v/v），在超声处理中超声处理约5-10分钟浴式超声波清洗器，直到沉淀物完全悬浮，在室温下以20,000×g离心5分钟，并将上清液转移到＃2管。
9. 用压力气体吹扫浓缩器用N 2气完全干燥管＃2中的合并的上清液。
10. 加入80μlCMW，涡旋，并在室温下以20,000×g离心1分钟。
11. 要通过温和的碱性水解去酰化甘油磷脂，加入16μl0.6N NaOH的甲醇溶液，涡旋混匀，在30℃孵育3小时。
12. 在室温下以20,000×g离心1分钟。
13. 为了中和，加入16μl0.6N乙酸的甲醇溶液，涡旋，并在室温下以20,000×g离心1分钟。
14. 使用压力气体吹扫浓缩器用N 2气体完全干燥反应混合物
15. 为了脱盐，向管＃2中加入100μl水，涡旋，并在室温下以20,000×g离心1分钟。
16. 进一步加入200μl水饱和的1-丁醇，涡旋，在室温下离心20,000×g离心5分钟，并将含有鞘脂的丁醇（上）相转移到新的1.5ml微量离心管（管＃ 3）。
17. 为了收集保留在管＃2中的放射性标记的鞘脂，向管＃2中加入200μl水饱和的1-丁醇，涡旋，在室温下离心20,000xg离心5分钟，并转移丁醇相到管＃3。重复此步骤一次。
18. 向管＃3中的合并的丁醇相中加入100μl水，涡旋，在室温下离心20,000×g离心5分钟，并将丁醇相转移到新的1.5ml微量离心管（＃4管）。
19. 使用压力气体吹扫浓缩器，用N 2气体完全干燥管＃4中的丁醇相。
脂质分离和分析
1. 向管＃4中加入25μlCMW，涡旋，并在室温下以20,000×g离心1分钟。
2. 然后将总样品加载到TLC板上
3. 将板放在玻璃TLC显影槽中，用氯仿 - 甲醇-4.2N氢氧化铵（9/7/2，v/v/v）溶剂混合物显影。
4. 当润湿前沿到达TLC板顶部1厘米以内时，从储罐中取出该板，并在室温下干燥
5. 当板用吹风机完全干燥时，将其置于曝光盒中，并将其暴露于氚敏感成像板几小时 - 几天。
6. 使用FLA-7000图像分析仪和软件捕获图像和量化信号（图1A）
神经酰胺提取和分析
1. 在含有TLC板的神经酰胺的区域添加几滴水，该板位于板的顶部边缘内部2或3cm内。
2. 通过用刮刀刮擦收集该区域的二氧化硅，并转移至1.5ml微量离心管（管＃5）。
3. 加入400μlCM，在浴型超声波清洗器中超声约5分钟，直到二氧化硅完全悬浮，在室温下以20,000×g离心5分钟，并将上清液转移到新的1.5ml微量离心机管（管＃6）。
4. 向管＃5中加入200μlCM，涡旋，在室温下以20,000×g离心5分钟，并将上清液转移到管＃6。
5. 使用压力气体吹扫浓缩器，用N 2气体完全干燥管＃6中的合并的上清液。
6. 向管＃6中加入100μl水，涡旋并在室温下以20,000×g离心1分钟。
7. 进一步加入200μl水饱和的1-丁醇，涡旋，在室温下离心20,000×g离心5分钟，并将含有神经酰胺的丁醇相转移到新的1.5ml微量离心管（＃7管）中。
8. 为了收集保留在管＃6中的放射性标记的神经酰胺，向管＃6中加入200μl水饱和的1-丁醇，涡旋，在室温下离心20,000分钟5分钟，丁醇相至管＃7。重复此步骤一次。
9. 使用N 2气体吹扫压缩气体吹浓缩器完全干燥管＃7中的丁醇相。
10. 向管＃7中加入25μlCMW，涡旋，并在室温下以20,000×g离心1分钟。
11. 然后将总样品加载到TLC板上
12. 将板放在玻璃TLC显影槽中，用氯仿 - 甲醇 - 乙酸（190/9/1，v/v/v）溶剂混合物显影。
13. 当润湿前沿到达TLC板顶部1厘米以内时，从储罐中取出该板，并在室温下干燥
14. 当板用吹风机完全干燥时，将其置于曝光盒中，并将其暴露于氚敏感成像板几小时 - 几天。
15. 使用FLA-7000图像分析仪和软件捕获图像和量化信号（图1B）。
  
  图1.捕获的图像显示了在TLC板上的复杂神经鞘脂（A）和神经酰胺（B）的分布和定量数据。野生型细胞用[3 H] ]在25℃下在不存在或存在2μg/ml金黄担子素A（AbA），特异性肌醇磷酰甘油酰胺（IPC）合酶抑制剂（Funato和Riezman，2001; Kajiwara等人， em>，2012）。提取标记的脂质，进行温和的碱性水解，并用氯仿 - 甲醇-4.2N氢氧化铵（9/7/2，v/v/v）溶剂混合物（A）通过TLC分析。通过刮取收集（A）中含有神经酰胺的级分（Funato和Riezman，2001），从二氧化硅中提取放射性标记的神经酰胺，并用氯仿 - 甲醇 - 乙酸（190/9/1，v/v/v）溶剂混合物（B）。将[3 H] DHS掺入复杂鞘脂（IPC-A，-B，-C，-D，MIPC和M（IP）2 C 8）中并掺入神经酰胺（Cer-A，-B和-C）被定量并确定为（A）中总放射性的百分比。 IPC-A，-B，-C，-D和Cer-A，-B，-C分别是不同的IPC亚类和神经酰胺物种（Haak等人，1997）。复杂的神经鞘脂和神经酰胺可以通过使用在特定鞘脂类物质的生物合成中有缺陷的突变体（Haak等人，1997），通过化学处理分离的放射性标记的脂质来鉴定（Puoti等人，，1991; Funato和Riezman，2001）或通过使用从[肌醇]标记的鞘脂中分离的脂质标准（Puoti等人， 1991; Haak等人，1997）。 MIPC，甘露糖基肌醇磷酰甘油酰胺; M（IP）2 C，甘露糖基二（肌醇磷酰）神经酰胺。

食谱

YPD液体介质
20克葡萄糖
10g酵母提取物
20克聚蛋白胨 40mg尿嘧啶
40 mg腺嘌呤
40 mg色氨酸
将H <2> O添加到1 L
通过高压灭菌消毒。
SD液体介质
20克葡萄糖
1.7g不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源 5.0g硫酸铵
80mg尿嘧啶
80 mg腺嘌呤
80mg亮氨酸
80 mg组氨酸
80mg赖氨酸
溶解在800ml H 2 O中用1M NaOH将pH调节至5.8-6.0 使用H 2 O调节体积至990ml
高压灭菌
灭菌加入10ml通过过滤灭菌的色氨酸溶液（8mg/ml）
水饱和的1-丁醇
将等体积的1-丁醇和H 2 O混合在室温下摇动一夜，然后离开
所得上相是水饱和的1-丁醇。

致谢

该协议改编自Kajiwara等人（2012）。这项工作是由生物圈科学研究生院（广岛大学），Kajiwara K.和日本科学促进会科学研究助理和教育，文化，体育，科学和技术的日本对Funato K.

参考文献

Funato，K。和Riezman，H。（2001）。酵母中神经酰胺从ER到高尔基体的水泡和非泡输送。 > J Cell Biol 155（6）：949-959
Haak，D.，Gable，K.，Beeler，T.and Dunn，T。（1997）。酿酒酵母的羟基化神经酰胺需要Sur2p和Scs7p。 J Biol Chem 272（47）：29704-29710。
Kajiwara，K.，Muneoka，T.，Watanabe，Y.，Karashima，T.，Kitagaki，H.and Funato，K。（2012）。神经鞘脂代谢紊乱会诱导内质网网状应激介导的线粒体凋亡在芽殖酵母中。 Mol微生物 86（5）：1246-1261。
Puoti，A.，Desponds，C.and Conzelmann，A。（1991）。甘露糖基肌醇磷酸酰胺的生物合成在酿酒酵母中依赖于控制分泌囊泡从内质网到高尔基体的流动。 J Cell Biol 113（3）：515-525 。